熊脫氧膽酸對梗阻性黃疸及膽汁內(nèi)外引流術(shù)后大鼠枯否細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的作用.pdf

1、[背景與目的]：梗阻性黃疸(OJ)病人術(shù)后常并發(fā)感染并死于敗血癥，提示OJ患者免疫功能減退。作為機體重要防御體系-網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)主要成員的枯否細(xì)胞(Kupffer cell)，成為了國內(nèi)外學(xué)者們關(guān)注的焦點。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟枯否細(xì)胞在膽管梗阻以后產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的一氧化氮，并且細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)增強。膽汁內(nèi)引流方法可以逆轉(zhuǎn)這種改變，而外引流方法則無此作用。提示膽汁內(nèi)引流術(shù)恢復(fù)枯否細(xì)胞免疫功能優(yōu)于

2、外引流術(shù)，可能與兩種膽汁引流方法所致的枯否細(xì)胞基因水平上的差異有關(guān)。由此我們提出假設(shè)：膽汁內(nèi)引流術(shù)優(yōu)于外引流術(shù)是基于內(nèi)毒素和膽汁酸鹽對梗阻性黃疸大鼠肝臟枯否細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的作用。目的：闡明內(nèi)毒素和親水性膽汁酸鹽對大鼠枯否細(xì)胞iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)的作用。 [方法]：采用成年雄性Sprague Dawley大鼠60只，隨機分成梗阻性黃疸(OJ)、膽汁內(nèi)引流(ID)、膽汁外引流(ED)和假手術(shù)(SH)4組，每組1

3、5只，通過第一次開腹手術(shù)結(jié)扎并切斷膽總管建立OJ模型，術(shù)后7天第二次手術(shù)，從膨大的膽管末端插入并固定引流管，經(jīng)皮下固定于大鼠頸背部皮膚建立ED模型；ID模型通過在膨大的膽管末端和十二指腸間植入支架形成。假手術(shù)組模型通過兩次開腹分離但不結(jié)扎膽總管方法建立。各組均于二次術(shù)后7天處死大鼠，留取標(biāo)本。我們采用Ⅳ型膠原酶原位灌注方法消化肝臟，經(jīng)Percoll密度梯度離心，分離出肝臟非實質(zhì)細(xì)胞，貼壁法進(jìn)一步分離、純化并培養(yǎng)枯否細(xì)胞，DAB免疫組織化

4、學(xué)染色鑒定枯否細(xì)胞。在我們之前單純用內(nèi)毒素(10ng/ml)干預(yù)的基礎(chǔ)上，加用親水性膽鹽熊脫氧膽酸(UDCA)(0.1mmol/L)干預(yù)枯否細(xì)胞生長，然后用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)半定量方法觀察UDCA對枯否細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA的表達(dá)水平的影響。 [結(jié)果]：成功建立四組大鼠動物模型。梗阻性黃疸形成后，大鼠進(jìn)食量減少，體重增長落后于假手術(shù)組(P＜0.01)；膽汁內(nèi)引流組在恢復(fù)大鼠食欲和體重方面，優(yōu)于外引流組(P＜

5、0.05)。 應(yīng)用UDCA(0.1mmol/L)和內(nèi)毒素(10ng/ml)共同干預(yù)15小時后，梗阻性黃疸組枯否細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平仍明顯高于假手術(shù)組(0.58±0.13vs0.38±0.07，P＜0.01)。膽汁外引流組(0.59±0.12)枯否細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)與梗阻性黃疸組比較無顯著性差異(P＞0.05)，仍顯著高于假手術(shù)對照組(P＜0.01)。膽汁內(nèi)引流組(0.45±0.12)枯否細(xì)胞iNOS mRNA

6、表達(dá)與假手術(shù)組比較無顯著性差異(P＞0.05)，均顯著低于膽汁外引流組(P＜0.01)。 與我們之前單純應(yīng)用LPS(10ng/ml)干預(yù)所得iNOS mRNA的r值結(jié)果[1]比較可見，四組大鼠肝臟枯否細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平均有不同程度的降低，其中梗阻性黃疸組與膽汁外引流組的枯否細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平明顯減弱(P＜0.01)，二組的下降幅度較膽汁內(nèi)引流組和假手術(shù)對照組有明顯差異(0.28±0.04、0.33±0