新城疫貴州不同分離株的蝕斑克隆與毒力鑒定.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒引起的一種急性、高度接觸性禽類(lèi)傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)定為A類(lèi)傳染病。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于新城疫的診斷，主要是采用傳統(tǒng)的病原分離鑒定及血凝抑制(HI)等血清學(xué)試驗(yàn)，雖為大家所公認(rèn)，但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。本文主要開(kāi)展了RT-PCR技術(shù)檢測(cè)新城疫病毒和鑒別新城疫強(qiáng)弱毒株的研究及蝕斑克隆技術(shù)純化NDV，為我省對(duì)新城疫的快速準(zhǔn)確診斷奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 1.應(yīng)用RT-PCR

2、試驗(yàn)，鑒定NDV及其強(qiáng)弱毒株 采用有關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成的針對(duì)NDV F蛋白的3對(duì)引物，對(duì)15株NDV進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)，鑒定NDV及其強(qiáng)弱毒株。三對(duì)引物分別對(duì)15株NDV分離株進(jìn)行鑒定，其結(jié)果與傳統(tǒng)毒力測(cè)定結(jié)果一致，該方法可以用于ND的診斷和NDV強(qiáng)弱毒株的鑒定。 為了將RT-PCR及上述引物應(yīng)用于新城疫的臨床診斷并推廣，使之具有更廣泛的應(yīng)用價(jià)值，我們采用該方法對(duì)貴州的13例禽類(lèi)送檢病例進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：RT-PCR可直

3、接對(duì)病料進(jìn)行檢測(cè)，能在6h內(nèi)確診并區(qū)分NDV強(qiáng)弱毒株，其病毒檢出率為15.38％(2/13)，與病毒分離率15.38％(2/13)完全相符。RT-PCR應(yīng)用于臨床診斷具有準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)方法的不足。 2．利用蝕斑克隆技術(shù)對(duì)ND毒株進(jìn)行純化 對(duì)2株NDV貴州分離株(GN、ND99)及2株疫苗毒株(Ⅰ系和Ⅱ系)進(jìn)行挑斑純化，結(jié)果得到12株克隆毒。經(jīng)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)，7株為弱毒，形成蝕斑的大小在0.3～1.0m

4、m；5株為強(qiáng)毒，其中4株形成蝕斑的大小在1.0～2.0mm，1株為形成蝕斑的直徑為0.4mm的紅色蝕斑；在胰酶存在的情況下，低毒力和中等毒力的NDV在雞胚成纖維細(xì)胞上都能形成蝕斑，所形成蝕斑的大小與病毒毒力具有相關(guān)性。 3．新城疫毒株毒力譜的構(gòu)建 通過(guò)傳統(tǒng)毒力指數(shù)測(cè)定結(jié)果和針對(duì)HN蛋白單克隆抗體的分群研究，結(jié)合RT-PCR對(duì)NDV貴州分離株的鑒定，綜合評(píng)價(jià)不同現(xiàn)場(chǎng)流行毒株的毒力，構(gòu)建新城疫病毒分離物的毒力譜如下：