熱休克蛋白47與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床預(yù)后相關(guān)性研究.pdf

1、[目的]
　　研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者熱休克蛋白47(HSP47)的表達(dá)特征，分析其與腫瘤形成及其臨床預(yù)后的相關(guān)性，并深入探討其潛在機(jī)制。
　　[方法]
　　收集膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者標(biāo)本，記錄并完善相關(guān)統(tǒng)計臨床資料。通過對NCI的REMBRANDT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，預(yù)測GBM病人HSP47基因表達(dá)與臨床預(yù)后的相關(guān)性。通過對74例膠質(zhì)瘤（纖維性星形細(xì)胞瘤患者12例，星形細(xì)胞瘤2級患者10例，少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤2級患者12例，間

2、變型星形細(xì)胞瘤患者20例，間變型少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者9例,GBM患者20例）及9例正常腦組織（腦挫裂傷周邊腦組織）石蠟切片標(biāo)本行免疫組化(IHC)半定量熱休克蛋白47在腫瘤組織中的表達(dá)位置以及差異情況。通過qPCR檢測50例膠質(zhì)瘤患者（Ⅰ級患者6例，Ⅱ級患者8例，Ⅲ級患者17例以及GBM患者19例）HSP47mRNA的表達(dá)水平。為進(jìn)一步明確熱休克蛋白47在細(xì)胞活性、腫瘤侵襲以及血管形成方面所起作用，我們應(yīng)用質(zhì)粒以及小于擾RNA(siRNA

3、)在三個GBM細(xì)胞系（U87，A172以及SHG66）進(jìn)行體內(nèi)外實驗。采用CCK8法測量細(xì)胞的活性變化;應(yīng)用transwell和細(xì)胞劃痕實驗來分析GBM細(xì)胞的侵襲性;對HUVECs細(xì)胞株進(jìn)行HSP47干預(yù)后的Tube formation實驗以檢測血管形成的影響。因HSP47與膠質(zhì)瘤血管形成具有相關(guān)性。為進(jìn)一步闡明HSP47下調(diào)后，與之相關(guān)聯(lián)的基因信號通路，我們采用RT2 ProfilerTM PCR基因芯片技術(shù)對與血管形成相關(guān)基因進(jìn)行篩

4、查;采取免疫印跡法分析影響血管形成相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　[結(jié)果]
　　免疫熒光以及組化結(jié)果顯示，HSP47主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，表達(dá)量隨腫瘤級別升高而增強(qiáng)，且明顯高于正常腦組織。同樣，隨著膠質(zhì)瘤級別的增加，其HSP47mRNA表達(dá)水平亦增強(qiáng)（P＜0.05）。我們對REMBRANDT數(shù)據(jù)庫不同HSP47表達(dá)水平病人的預(yù)后情況（分別為GBM/Normal≥2，GBM/Normal≥4，GBM/Norma

5、l≥6，GBM/Normal≥8，GBM/Normal≥10）進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，隨著HSP47表達(dá)量不斷升高，高表達(dá)HSP47的GBM病人(GBM/Normal≥6，n=150)其總體生存時間明顯少于HSP47低表達(dá)的GBM病人（n=31，P=0.016）。通過小干擾RNA(siRNA)敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87，A172以及SHG66的HSP47的表達(dá)后，細(xì)胞活性的顯著下降以及侵襲性降低。細(xì)胞活性在干預(yù)后96小時分別下降了23.4％，18.

6、9％以及15.9％;細(xì)胞transwell實驗顯示U87，A172以及SHG66細(xì)胞侵襲力在轉(zhuǎn)染后48小時分別下降了75.7％-82.7％，82.8％-88.3％，30.1％-37.3％。同時裸鼠在體移植瘤試驗中，下調(diào)HSP47后，腫瘤的生長體積以及重量出現(xiàn)明顯減小。此外，下調(diào)HSP47表達(dá)能顯著降低HUVECs細(xì)胞的血管形成能力。而且，HSP47基因沉默后可增加GBM細(xì)胞對替莫唑胺(TMZ)藥物治療的敏感性，在轉(zhuǎn)染后48小時，U87，

7、A172以及SHG66細(xì)胞的藥物敏感性分別提高了16.8％和4.8％，16.9％。另外，在質(zhì)粒干預(yù)過表達(dá)HSP47后，細(xì)胞的增殖以及侵襲性都有不同程度的提高，對藥物敏感性亦產(chǎn)生變化。對基因芯片所得結(jié)果進(jìn)行處理后，我們發(fā)現(xiàn)，雖然三個細(xì)胞株結(jié)果不盡相同，但其中仍有12個基因具有明顯變化，且其中有11個基因在SHG66和A172中是明顯下調(diào)的。在對血管形成相關(guān)信號通路進(jìn)行實驗后結(jié)果顯示，SHG66細(xì)胞株中，基因沉默HSP47可顯著減少HIF1