組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯(lián)合唑來膦酸對多發(fā)性骨髓瘤荷瘤小鼠抗腫瘤作用及機制的研究.pdf

1、目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是發(fā)生于B淋巴細胞終末階段的漿細胞惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的1％，血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％，在歐美國家已成為僅次于非霍奇金淋巴瘤的第二大常見血液系統(tǒng)惡性腫瘤。多發(fā)于中老年人，至今尚不能完全治愈。近年來，干細胞移植及萬珂等新藥的應(yīng)用雖然在一定程度上改善了MM患者的預(yù)后，但是仍存在移植相關(guān)毒性、多藥耐藥等諸多問題。因此，尋求新的有效藥物以延緩疾病進展、延長緩解期成為了目前的研究熱點。

2、唑來膦酸(zoledronicacid，ZOL)作為新一代的雙膦酸鹽類藥物，通過抑制破骨細胞活性進而抑制骨吸收，并可逆轉(zhuǎn)骨溶解病變的進展。目前已應(yīng)用于惡性腫瘤溶骨性骨轉(zhuǎn)移引起的骨痛、高鈣血癥、多發(fā)性骨髓瘤及肺癌等。國內(nèi)外眾多臨床前研究提示，ZOL通過直接機制（腫瘤細胞黏附、侵襲、凋亡）和間接機制（血管生成、γδT細胞）發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)可使腫瘤細胞中組蛋白去乙?；教岣撸T導(dǎo)特定基因激活表達，導(dǎo)致腫瘤

3、細胞的凋亡。LBH-589是氧肟酸鹽類HDACi，在臨床實驗中，對多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤細胞均顯示出抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。在我科前期臨床試驗中，LBH-589對骨髓瘤細胞顯示出較強的活性(IC50＜40nmol/L)。β2微球蛋白（bate2-microglobulin，β2-MG）是人類HLA抗原的一個亞基，主要表達于B細胞系統(tǒng)及單核細胞系統(tǒng)。MM患者可大量合成β2-MG并進入血液循環(huán)，故臨床上可作為判斷MM病情、治療效果及預(yù)后

4、的指標(biāo)。本實驗深入探討了組蛋白去乙?；敢种苿┡c唑來膦酸以不同方式聯(lián)合應(yīng)用對多發(fā)性骨髓瘤荷瘤鼠的作用，并通過細胞凋亡檢測及血清β2微球蛋白(β2-MG)水平的定量以評價對多發(fā)性骨髓瘤的療效，以期為臨床治療提供更多的手段及方法。
　　 方法:
　　 1、細胞培養(yǎng)和傳代人多發(fā)性骨髓瘤細胞株KM3細胞，用含10％滅活胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃，50mL/LCO2的

5、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代1次，實驗采用對數(shù)生長期細胞，臺盼藍染色拒染率95％以上。
　　 2、建立KM3荷瘤裸鼠模型
　　 將處于對數(shù)生長期的KM3細胞用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次后，重懸于1∶1混勻無血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為1×108/ml，每只裸鼠右前肢外側(cè)皮下接種0.2ml(細胞數(shù)2×107/只)，共接種26只。
　　 3、觀察裸鼠成瘤率
　　 各組裸鼠以接種瘤細

6、胞后15天為限，裸鼠右前肢外側(cè)可見可測量腫塊為標(biāo)準，成瘤率=成瘤只數(shù)/總只數(shù)×100％。
　　 4、實驗動物分組
　　 成瘤裸鼠16只，隨機分為4組（每組4只）:a.空白組;b.唑來膦酸組;c.LBH-589組;d.唑來膦酸與LBH-589聯(lián)合用藥組。各組以接種瘤細胞后第16天開始，a組不予用藥，b組及c組每只裸鼠分別皮下注射濃度為0.1μmol/L的唑來膦酸及濃度為5nmol/L的LBH-589各0.2ml，d組每只裸

7、鼠先后皮下注射濃度為0.1μmol/L的唑來膦酸及濃度為5nmol/L的LBH-589各0.2ml;每隔2d注射一次，共注射5次（上述各組劑量參照我科前期體外實驗確定）。
　　 5、抗腫瘤效果觀察
　　 5.1、觀察荷瘤小鼠的一般情況及腫瘤的形態(tài)、體積變化:
　　 5.1.1、觀察荷瘤小鼠的一般情況:包括精神狀況、皮膚光澤、活動度、飲食、飲水情況及體重變化。
　　 5.1.2、藥物5次注射完畢4周后斷頸處

8、死荷瘤小鼠，剝離腫塊，測量腫塊的長徑及短徑，并根據(jù)公式計算腫瘤體積和腫瘤生長抑制率(IR):V=(長徑×短徑2)/2;IR=(V0-Vn)/V0×100％(V0代表空白組的腫瘤體積，Vn為治療組的腫瘤體積);各組裸鼠腫瘤體積均取其平均值。
　　 5.2、細胞凋亡檢測將剝離的實體瘤組織解聚、分散，制備成組織勻漿，用流式細胞儀檢測唑來膦酸單藥組、LBH-589單藥組及兩藥聯(lián)合用藥組的KM3細胞凋亡率。
　　 5.3、應(yīng)用放射

9、免疫法(RIA)測定β2-MG水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、人KM3細胞裸鼠皮下移植瘤的成瘤:接種后4天于接種處，即右前肢外側(cè)可見微小突起，約7-9天后可見注射部位出現(xiàn)可測量腫塊，隨時間推移腫物不斷增大，接種成瘤率65.38％(17/26)。成瘤15天后移植瘤短徑基本都在5mm以上，取其中腫物形態(tài)、大小相近的16只裸鼠用于實驗分組。
　　 2、實驗動物的一般狀況:a組裸鼠在實驗后期日漸衰竭，精神萎靡，皮膚暗淡，

10、飲食及飲水量較前明顯減少，體重明顯減輕。b組與c組裸鼠精神尚可，活動度略差，飲食、飲水量輕度減少。d組裸鼠精神狀況、活動度、皮膚、飲食飲水量及體重均未見明顯異常變化。
　　 3、各實驗組荷瘤小鼠的腫瘤形態(tài)及體積變化:a組隨時間延長，腫瘤體積明顯逐漸增大。b組及c組腫瘤體積稍有增大。d組隨時間延長腫瘤體積未見明顯增大，甚至稍有縮小。
　　 4、各實驗動物經(jīng)治療4周后計算腫瘤生長抑制率，結(jié)果:b、c、d組依次為71.97％、

11、69.16％、94.27％。各治療組與空白組之間差異有顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，單藥組與聯(lián)合用藥組之間差異具有顯著性(P＜0.05)。根據(jù)各組裸鼠腫瘤的一般情況及治療后對腫瘤生長抑制率的計算結(jié)果表明，唑來膦酸及LBH-589可抑制多發(fā)性骨髓瘤KM3荷瘤裸鼠移植腫瘤生長，且兩藥有協(xié)同抑制作用。
　　 5、應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測KM3細胞凋亡:唑來膦酸單藥組、LBH-589單藥組及兩藥聯(lián)合用藥組應(yīng)用于KM3荷瘤裸鼠后，均在G

12、0/G1峰前出現(xiàn)了亞二倍體細胞峰，表明各組均出現(xiàn)了細胞凋亡，并且唑來膦酸聯(lián)合LBH-589用藥與二者單獨應(yīng)用相比，促進了KM3細胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　 6、各組荷瘤小鼠采用摘除眼球采血法，采集靜脈血約0.6-1ml/只，應(yīng)用放射免疫法（RIA）測定β2-MG水平。唑來膦酸組、LBH-589組及聯(lián)合用藥組β2-MG水平均較空白組有所下降，且兩藥聯(lián)合較單藥組下降水平更加明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0