咪達普利拉對白介素-1β誘導的心臟成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2和抑制劑-2的作用及其機理研究.pdf

1、研究背景： 炎癥因子對心肌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重構(gòu)有重要的病理生理學作用。在調(diào)節(jié)ECM降解和合成中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是主要的酶類。心肌組織中MMP-2是最為廣泛分布的MMP，MMP-2組織抑制劑(type 2 tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMP-2)是MMP-

2、2的內(nèi)源性抑制劑，與MMP-2一起參與調(diào)節(jié)ECM的動態(tài)平衡?，F(xiàn)有資料表明小鼠MMP-2、MMP-9基因敲除后，明顯延緩了左室重構(gòu)，心肌失代償和心力衰竭的進展。 白介素-1β(interleukin--1β，IL-1β)是心力衰竭中主要的炎癥因子，它可影響心臟成纖維細胞血管緊張素受體1A的表達；誘導MMP-9、MMP-2的表達和活性增高，參與ECM的重構(gòu)。一氧化氮(nitric oxide，NO)是體內(nèi)重要的細胞內(nèi)信號分子，它的合

3、成受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的調(diào)控。其中誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)在正常情況下不表達，內(nèi)毒素或炎癥因子刺激時可被迅速誘導，促進NO的大量生成，從而誘發(fā)各種病理生理過程，其中包括促進心臟成纖維細胞MMP-2合成和活性增加。研究表明心臟成纖維細胞iNOS-NO系統(tǒng)也是IL-1β作用的靶點，但目前對于IL-1β是否能通過iNOS-NO系統(tǒng)影響心臟成纖維細胞MMPs以及TIMP

4、s的表達還無相關(guān)報道。 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)是治療慢性心力衰竭的基石藥物，它具有明顯的抗心肌重構(gòu)作用，但詳細機制仍有待進一步揭示。在鹽敏感的Dah1大鼠上發(fā)現(xiàn)ACEI能抑制心肌iNOS的表達，延緩心肌重構(gòu)進程和心力衰竭的發(fā)生，同樣在自發(fā)性大鼠模型上ACEI減輕了MMPs的基因表達和活性增高，并縮小了左室內(nèi)徑。上述ACEI的抗心肌重構(gòu)作用

5、顯然有別于傳統(tǒng)機制，即通過阻滯組織和循環(huán)血管緊張素Ⅱ生成，抑制緩激肽降解發(fā)揮抗心肌重構(gòu)作用，但目前對此機理研究鮮有報道。針對上述問題本研究擬探索炎癥因子IL-1β是否能通過iNOS-NO系統(tǒng)影響心臟成纖維細胞MMPs/TIMPs的平衡；ACEI是否對心臟成纖維細胞MMPs/TIMP-2的失衡有糾正作用。 目的： (1)觀察IL-1β對人心臟成纖維細胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2的作用及相關(guān)機理； (2)觀

6、察ACEI制劑咪達普利拉(imidaprilat)對心臟成纖維細胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2的影響及可能機理； (3)觀察咪達普利拉對IL-1β誘導地心臟成纖維細胞MMP-2、MMP-9和TIMP-2的影響及可能機理。 方法： 細胞培養(yǎng)將人心臟成纖維細胞以5×104/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待實驗選用的3-6代細胞群80-90％融合后用無血清完全培養(yǎng)基(CS-C medium，CSM)繼續(xù)培養(yǎng)，24

7、h后用PBS洗滌細胞2次并接受各種干預(yù)措施?！　T-PCR待實驗細胞接受干預(yù)12h后，提取細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)基因庫內(nèi)GAPDH、MMP-2、TIMP-2、MMP-9基因全序列設(shè)計相應(yīng)引物，進行PCR擴增。以特異性MMP-2、MMP-9和TIMP-2擴增條帶灰度與對應(yīng)GAPDH擴增條帶灰度比值對mRNA表達量進行半定量分析。 酶譜分析細胞約80-90％融合并用CSM 孵育24h后，接受含IL-1β(1ng/ml～10

8、ng/ml)和/或咪達普利拉(10-9M～10-6M)的CSM繼續(xù)孵育24h。完成各種干預(yù)后，收集培養(yǎng)上清。通過凝膠酶譜進行MMP-2、MMP-9的活性檢測，上樣量通過對應(yīng)細胞蛋白含量進行標化。MMPs顯示為位于藍色背景上的透亮帶，采用條帶密度分析儀進行圖像分析并測定吸光度值。 NO測定采用Griess法測定樣品中的亞硝基(nitrite，NO2)含量來衡量細胞上清中NO水平。取培養(yǎng)上清100μ1與等量的Griess試劑(Griess試

9、劑A和Griess試劑B各一份)，室溫反應(yīng)10分鐘后，用酶聯(lián)儀測A540nm波長下吸光度值。用NaNO2作標準曲線。 Western blot細胞接受各種刺激24h后，收集細胞總蛋白，采用Western blot法測定細胞iNOS蛋白的表達，用條帶密度分析儀進行圖像分析并測定吸光度值。 數(shù)據(jù)分析每組實驗重復(fù)4次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。利用SPSS 11.5軟件處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)的比較采用方差分析，有顯著差異者用LSD

10、檢驗。兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.通過凝膠酶譜分析表明人心臟成纖維細胞能分泌MMP-2，但我們的實驗系統(tǒng)難以發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細胞MMP-9的分泌。通過RT-PCR檢測到MMP-2、TIMP-2的mRNA表達，但試用各種循環(huán)參數(shù)也難以發(fā)現(xiàn)MMP-9的mRNA表達，而同樣的引物能在陽性對照(人巨噬細胞)上發(fā)現(xiàn)MMP-9的mRNA表達。 2.人心臟成纖維細胞接受IL-1β刺激24h

11、后，酶譜分析結(jié)果表明IL-1β促進了細胞MMP-2的活性增加，4ng/ml的IL-1β刺激作用達到高峰，與對照組相比活性增加了170.24±13.12％(P<0.01)，而10ng/ml IL-1β刺激組與4ng/ml IL-1β刺激組相比，兩者間MMP-2活性無明顯差異(P>0.05)。 3.IL-1β干預(yù)心臟成纖維細胞12h后，通過RT-PCR結(jié)果表明：與正常對照組相比，4ng/ml IL-1β組MMP-2 mRNA表達明顯

12、增加(P<0.01)；10ng/ml IL-1β組MMP-2 mRNA表達與4ng/ml IL-1β組MMP-2 mRNA表達相比無明顯差異(P>0.05)。 4.心臟成纖維細胞接受IL-1β刺激24h后，通過酶譜分析結(jié)果表明IL-1β時間依賴性地促進心臟成纖維細胞MMP-2的活性增加，刺激24h作用達到高峰，與對照組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。 5.心臟成纖維細胞接受IL-1β刺激24h后，提取其上清，通過G

13、riess法檢測表明IL-1β(4ng/ml)可以明顯促進細胞NO水平升高(P<0.01)，而iNOS抑制劑NG-甲基-L-精氨酸(NG-methyl L-Arginine，L-NMMA，10-3M)顯著抑制了IL-1β誘導的MMP-2 mRNA表達(P<0.01)、MMP-2活性(P<0.01)以及NO的升高(P<0.01)。通過Westen blot發(fā)現(xiàn)在生理水平的心臟成纖維細胞上未能檢測到iNOS蛋白的表達，而不同濃度的IL-1β

14、明顯促進細胞iNOS的蛋白合成。 6.通過酶譜分析和RT-PCR結(jié)果表明咪達普利拉在實驗所選濃度范圍內(nèi)對心臟成纖維細胞MMP-2的活性(P>0.05)和mRNA表達(P>0.05)無明顯影響。 7.心臟成纖維細胞接受咪達普利拉(10-9～10-6M)和IL-1β(4ng/ml)聯(lián)合作用后，通過酶譜分析結(jié)果表明咪達普利拉可以濃度依賴性地抑制IL-1β誘導地細胞MMP-2的活性增高(P<0.01)。 8.心臟成纖維細

15、胞在咪達普利拉(10-7M)和IL-1β(4ng/ml)聯(lián)合作用后，通過Griess法發(fā)現(xiàn)咪達普利拉抑制了IL-1β誘導地細胞上清NO水平的上升(P<0.01)，通過Westen blot發(fā)現(xiàn)咪達普利拉抑制了IL-1β誘導地細胞iNOS蛋白的增加(P<0.01)；而SNP頓挫了咪達普利拉的作用，包括對IL-1β誘導地MMP-2 mRNA表達(P<0.01)、MMP-2活性(P<0.01)的抑制和對IL-1β誘導地iNOS蛋白表達的抑制(

16、P<0.01)。 9.心臟成纖維細胞接受IL-1β(4ng/ml)和咪達普利拉(10-7M)刺激12h后，通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)它們對細胞TIMP-2 mRNA表達無明顯影響(P>0.05)。 10.通過體外鰲合實驗發(fā)現(xiàn)咪達普利拉(10-7M，主要實驗濃度)未能通過對鰲合作用競爭性抑制MMP-2的活性(P>0.05)，而EDTA明顯抑制MMP-2的活性(P<0.01)。 結(jié)論 (1)IL-1β能促進心臟成纖

17、維細胞MMP-2的mRNA表達和MMP-2活性增加，并提示其作用與細胞iNOS-NO水平相關(guān)。 (2)咪達普利拉對未受干預(yù)的心臟成纖維細胞MMP-2 mRNA表達和活性無明顯影響，但它能抑制IL-1β誘導地心臟成纖維細胞MMP-2 mRNA表達和活性的增加，其機理可能咪達普利拉抑制了IL-1β誘導地心臟成纖維細胞iNOS蛋白的合成以及NO水平升高，進而影響MMP-2表達與活性。 (3)IL-1β和咪達普利拉對心臟成纖維細