CT基因PRTD-NY2的功能研究.pdf

1、精子發(fā)生和腫瘤之間存在許多相似性，其中一個重要的標志就是數量不斷增加的腫瘤/睪丸((2ancer/testis，CT)基因的發(fā)現。發(fā)現并研究CT基因的功能，有利于對精子發(fā)生和腫瘤機制的闡明。 PRTD-NY2是本實驗室在成人睪丸中克隆出的一條新基因，生物信息學提示它是一個F/RL家族的RGS蛋白，并且該基因的染色體定位區(qū)域與腫瘤的發(fā)生密切相關。本研究中，我們對PRTD-NY2基因在精子發(fā)生和腫瘤發(fā)生過程中的作用及其機制進行了探討

2、。 首先我們通過RT-PCR發(fā)現PKTD-NY2為CT基因。人睪丸組織免疫組化，顯示PRTD-NY2蛋白細胞定位在生精上皮的精原細胞和精母細胞細胞漿以及精子細胞的細胞漿和細胞核中表達；精子免疫熒光提示PRTD-NY2定位于核后區(qū)的胞漿和胞質殘余體中；RT-PCR顯示PRTD-NY2在成人睪丸高表達；在唯支持細胞綜合癥患者中不表達；在生精阻滯于精子細胞前的病人中幾無表達，從而提示PRTD-NY2可能主要在精子細胞及以后的精子發(fā)生中

3、發(fā)揮作用。 RGS蛋白可以直接與激活的Gα亞基結合來負調節(jié)G蛋白信號，即失活G α亞基并降低G蛋白偶聯受體(GPCR)信號，為負調控因子。因此進一步我們通過Pull down和免疫共沉淀證實在睪丸中PRTD-NY2能和G蛋白cc亞基12、13及q相互作用。PRTD-NY2作為RGs蛋白，其在睪丸中的作用通過抑制G蛋白α亞基12、13及q通路而體現。 因此，我們對Gα12在精子發(fā)生中的作用進行了研究。發(fā)現GCcl2蛋白表達

4、在Leydig細胞以及sb期開始變形的精子細胞以后的各級生精細胞的細胞漿中，在精子中主要定位于頸部中心粒以及中段。通過正常睪丸和精子中F-actin以及α-tubulin與Gal2的共定位研究，提示Gal2可能參與了F-actin和α-tubulin介導的為精子細胞極性和尾部形成而產生的細胞骨架重組。非阻塞型無精癥患者睪丸中Gα12的表達缺陷可能是導致精子發(fā)生障礙的原因之一。低活力的精子Gα12表達異常，并且Gα12的表達異常主要在中段

5、卷曲的精子中發(fā)生，提示在精子變形前兩個階段Gal2產生異常或部位改變，和/或最后階段的保留異?？赡苁菍е戮踊盍Φ拖碌脑?。PRTD-NY2在精子細胞漿中有表達，并且與Gα12相作用，可能協同參與了精子變形過程中細胞極性和尾部形成相關的細胞骨架重組。接著，我們又對Gctl3在精子發(fā)生中的功能進行了研究，發(fā)現人睪丸和精子均有Gα13的表達，并且小鼠睪丸及精子中Gα13的表達片段大小與體組織中一致。免疫組化發(fā)現在人和小鼠睪丸中G α13表達

6、于精原細胞和精母細胞的胞漿而在延伸的精子細胞的細胞核；小鼠各級生精細胞的免疫熒光也觀察到Gα13從圓形精子細胞漿隨著精子變形轉運入核；人精子免疫熒光檢測證實Gα13表達于細胞核。這些均與Gα13在體組織中的亞細胞定位不同。Gα13在不育患者的大頭精子中表達異常，這提示α13與精子核的正確變形相關。通過PRTD-NY2的睪丸免疫組化和PRTD-NY2)片段的亞細胞定位研究，我們發(fā)現其定位與Gα13高度一致，且其N端具有核定位信號，提示在核

7、變形的過程中，睪丸特異的PRTD-NY2可以協同G α13從胞漿轉運至胞核，從而參與了核濃縮。 最后我們對PRTD-NY2基因在腫瘤發(fā)生過程中的功能及機制進行探討。96例人腫瘤組織芯片分析，發(fā)現PRTD-NY2蛋白表達于上皮來源的腫瘤(主要是鱗狀細胞癌和腺癌)中。多種鱗癌及腺癌腫瘤組織及食道癌組織芯片的免疫組織化學、不同遷移能力的腫瘤細胞系的RT-PCR和Western Blot、超表達及RNAiPRTD-NY2的腫瘤細胞在裸鼠

8、體內所致的腫瘤轉移實驗均提示PRTD-NY2與腫瘤的轉移相關，其具有抑制腫瘤轉移的作用。 PRTD-NY2在大腸桿菌和多種腫瘤細胞中均可通過不同的翻譯起始位點翻譯為不同片段大小的蛋白。PRTD-NY2在腫瘤細胞中可表達146KD片段和76KD片段，能抑制腫瘤細胞在裸鼠腹腔內的種植轉移和向遠處器官肺臟的轉移。PRTD-NY2對腫瘤細胞的粘附力無影響，劃痕實驗和transwell實驗均證實PRTD-NY2能降低腫瘤細胞在LPA刺激下的遷移。

9、腫瘤細胞的pull down和LPA激的細胞變形實驗證實：PRTD-NY2是通過與G α12/13相作用，抑制LPA刺激的G α12/13介導的F-actin的形成。劃痕實驗和transwell實驗還發(fā)現僅有76KD)片段大小的PRTD-NY2表達也可顯著抑制腫瘤細胞在LPA刺激下的遷移，提示76KD的片段可能是PRTD-NY2抑制腫瘤轉移的主要形式。 綜上所述，PRTD-NY2是一個新CT基因，在睪丸中它能與Gal2、Gα13