IgA分泌細(xì)胞在IgA腎病中的分布和遷移研究.pdf

1、第一部分IgA 腎病小鼠模型的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：用黏膜免疫誘導(dǎo)法構(gòu)建IgA 腎病小鼠模型，以作為后期進(jìn)行IgA 腎病發(fā)病機(jī)制研究及探討IgA 腎病的預(yù)防和治療策略的基礎(chǔ)。
　　 方法：采用口服牛血清白蛋白，后期聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B的方法來(lái)誘導(dǎo)構(gòu)建IgA 腎病小鼠模型。每隔4周收集24h 尿液檢測(cè)尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，并采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)24h 尿蛋白定量。12周末處死動(dòng)物，收集血液檢測(cè)小鼠血清白蛋白(ALB)、

2、總蛋白(TP)、膽固醇(CHOL)及肌酐(Cr)含量；收集腎組織標(biāo)本用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織IgA的表達(dá)狀況；腎組織切片分別進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色及過(guò)碘酸-希夫(PAS)染色，于普通光鏡下觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)改變。
　　 結(jié)果：模型小鼠免疫組化檢測(cè)反映IgA在系膜區(qū)呈團(tuán)塊狀彌漫性沉積，病理上呈典型的系膜增生性腎炎改變。模型小鼠臨床上出現(xiàn)典型的蛋白尿，自8周末始24h 尿蛋白定量較正常對(duì)照組開始增加，12周末時(shí)達(dá)高峰（2.3

3、2±0.38 mg/24 h）。
　　 結(jié)論：口服牛血清白蛋白聯(lián)合尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B的方法能成功構(gòu)建小鼠IgA 腎病模型，是一種適合國(guó)內(nèi)當(dāng)前實(shí)際的較為理想的造模方法，其成功構(gòu)建提示黏膜免疫的啟動(dòng)可能參與了IgA 腎病的發(fā)生過(guò)程。
　　 第二部分IgA分泌細(xì)胞在IgA 腎病小鼠體內(nèi)的異常分布及FTY720 對(duì)其的影響
　　 目的：比較分泌IgA的B 淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞在IgA 腎病小鼠骨髓、Peyer 小結(jié)及

4、小腸固有膜等組織的分布差異，并在此基礎(chǔ)上給予FTY720 阻斷淋巴細(xì)胞向骨髓的遷移，觀察其對(duì)IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞的組織分布影響。
　　 方法：誘導(dǎo)小鼠IgA 腎病模型，采用Ficoll 密度梯度離心法分離骨髓及Peyer小結(jié)淋巴細(xì)胞，采用連續(xù)Percoll 密度梯度離心法分離小腸固有膜的淋巴細(xì)胞；利用三色流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)分別檢測(cè)IgA、B220、CD38在來(lái)自骨髓、Peyer 小結(jié)及小腸固有膜的淋巴細(xì)胞表面的表達(dá)狀

5、況，進(jìn)而得出IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞在小鼠骨髓、Peyer 小結(jié)、小腸固有膜等組織的分布差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.骨髓中：IgA+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平在模型小鼠中較正常小鼠明顯增加，IgA+B220+淋巴細(xì)胞/IgA+淋巴細(xì)胞水平較正常小鼠減少,最終IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平在模型小鼠中較正常小鼠明顯增加；FTY720 處理小鼠IgA+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平、IgA+B220+淋巴

6、細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平及IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平均較模型組小鼠減少。
　　 2.Peyer 小結(jié)中：同正常對(duì)照比較，模型小鼠Peyer 小結(jié)中IgA+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平略升高，但是IgA+B220+淋巴細(xì)胞/IgA+淋巴細(xì)胞水平降低，最終IgA+B220+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平降低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見(jiàn)顯著性差異； IgA+B220-淋巴細(xì)胞/IgA+淋巴細(xì)胞水平及IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平略升

7、高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異。FTY720 處理小鼠IgA+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平及IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平較模型小鼠及對(duì)照小鼠明顯增高，而IgA+B220+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平則略有降低。
　　 3.小腸固有膜中：模型小鼠IgA+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平、IgA+B220+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平及IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平均較正常小鼠有所降低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尚不顯著；FTY720 處理小鼠Ig

8、A+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平、IgA+B220+淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平及IgA+B220-淋巴細(xì)胞/總淋巴細(xì)胞水平較正常對(duì)照小鼠及模型小鼠均減少。
　　 結(jié)論：小鼠IgA 腎病模型骨髓中IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了增多，而腸道黏膜組織中IgA+B 淋巴細(xì)胞數(shù)量并未增多，且固有膜中IgA+漿細(xì)胞減少，這可能是由于Peyer 小結(jié)中本應(yīng)向固有膜遷移的IgA+B 淋巴細(xì)胞出現(xiàn)了轉(zhuǎn)向于骨髓的錯(cuò)位遷移，并在骨髓中發(fā)育為

9、產(chǎn)pIgA的漿細(xì)胞。FTY720 可誘導(dǎo)IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞向Peyer 小結(jié)歸巢，從而減少骨髓中漿細(xì)胞的數(shù)量。
　　 第三部分CCL28、SDF-1、MadCAM-1 調(diào)節(jié)IgA 腎病小鼠體內(nèi)IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞的錯(cuò)位遷移
　　 目的：檢測(cè)CCL28、MadCAM-1、SDF-1等主要介導(dǎo)淋巴細(xì)胞遷移及歸巢的趨化因子及黏附分子在Peyer 小結(jié)、小腸固有膜、骨髓及腎臟組織的表達(dá)狀況，以證

10、實(shí)淋巴細(xì)胞歸巢因子在調(diào)節(jié)IgA 腎病小鼠體內(nèi)IgA+B 淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞的錯(cuò)位遷移及IgA腎病發(fā)病機(jī)制中所起的作用。
　　 方法：制作小鼠IgA 腎病模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CCL28 及Madcam-1 小腸中的表達(dá)及SDF-1在骨髓、腎皮質(zhì)的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用蛋白免疫印跡法半定量測(cè)定Peyer小結(jié)及小腸組織中 CCL28、MadCAM-1的蛋白表達(dá)量以及骨髓、腎臟組織中SDF-1的蛋白表達(dá)量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法半定

11、量檢測(cè)小腸組織CCL28、MadCAM-1的 mRNA表達(dá)及骨髓、腎臟組織中SDF-1mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1）免疫組織化學(xué)法顯示，CCL28 陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于小腸黏膜固有層，正常小鼠小腸黏膜固有層呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，模型小鼠表達(dá)明顯減少，經(jīng) FTY720 干預(yù)小鼠陽(yáng)性表達(dá)較模型小鼠略有增加；MadCAM-1在三組小鼠小腸黏膜固有層均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，模型小鼠及FTY720 干預(yù)小鼠陽(yáng)性表達(dá)較正常小鼠少；SDF-1在骨髓

12、的陽(yáng)性表達(dá)以間質(zhì)明顯，三組小鼠均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，但組間差別不顯著；SDF-1 腎臟組織的陽(yáng)性表達(dá)主要見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞，在正常小鼠中呈弱表達(dá)，在模型組中陽(yáng)性表達(dá)增多，經(jīng) FTY720干預(yù)小鼠較模型表達(dá)減弱。
　　 2）蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)，在Peyer 小結(jié)中，模型小鼠CCL28蛋白表達(dá)量較正常小鼠明顯降低，MadCAM-1的表達(dá)量也明顯降低，F(xiàn)TY720 處理小鼠CCL28 及MadCAM-1的蛋白表達(dá)較正常小鼠也降低，但同模型小

13、鼠比較無(wú)顯著性差異；小腸固有膜中，模型小鼠及FTY720 處理小鼠CCL28蛋白表達(dá)量均較正常降低，但兩組彼此間無(wú)顯著性差異；同正常對(duì)照比較，模型小鼠 SDF-1的蛋白表達(dá)量在骨髓中輕微降低，在腎臟中輕微增加，F(xiàn)TY720處理小鼠SDF-1的蛋白表達(dá)量在骨髓及腎臟較模型小鼠及正常小鼠均略有增多，但都缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR法發(fā)現(xiàn)，小腸CCL28 mRNA的表達(dá)量在模型小鼠較正常小鼠降低，在FTY720 處理

14、小鼠也較正常小鼠降低，MadCAM-1的表達(dá)量在模型鼠降低，在FTY720 處理小鼠有所增加，但是缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型小鼠 SDF-1的mRNA表達(dá)量較正常小鼠在骨髓中減少，在腎臟中增加；FTY720 處理小鼠mRNA表達(dá)量在骨髓中較模型小鼠增多，在腎臟中較模型小鼠減少，但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1）小鼠IgA 腎病時(shí)，腸道粘膜組織CCL28 及MadCAM-1表達(dá)下調(diào)，因而原本應(yīng)定向小腸固有膜歸巢的IgA

15、分泌細(xì)胞遷移減少；在骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的CCL28或其他因子或因素作用下，IgA分泌細(xì)胞出現(xiàn)了定向骨髓的錯(cuò)位遷移，導(dǎo)致骨髓中IgA分泌漿細(xì)胞增多并產(chǎn)生過(guò)量的致病性IgA分子。
　　 2）SDF-1 可能并非導(dǎo)致IgA分泌細(xì)胞錯(cuò)位遷移的關(guān)鍵分子，SDF-1在IgA 腎病小鼠腎臟的表達(dá)增加更可能是機(jī)體對(duì)腎臟已經(jīng)出現(xiàn)損傷的一種反應(yīng)。
　　 3）FTY720與CCL28 及MadCAM-1在小腸粘膜組織的表達(dá)紊亂可能并無(wú)直接聯(lián)系，

16、FTY720 減少骨髓中漿細(xì)胞的數(shù)量與其選擇性誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞向次級(jí)淋巴器官歸巢有關(guān)。
　　 第四部分FTY720 及環(huán)孢霉素A 用于IgA 腎病模型小鼠治療的效果觀察
　　 目的：觀察FTY720用于IgA腎病模型小鼠治療的效果，并進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法：首先誘導(dǎo)IgA腎病模型，自造模10周后始分別應(yīng)用FTY720及環(huán)孢霉素A干預(yù)IgA腎病小鼠，比較FTY720干預(yù)組小鼠與IgA腎病模型組小鼠之間在病理及臨床

17、表現(xiàn)的差異，同時(shí)比較FTY720干預(yù)組小鼠與環(huán)孢霉素A干預(yù)組小鼠之間在病理及臨床表現(xiàn)的差異。
　　 結(jié)果：12周末時(shí)模型組小鼠尿蛋白達(dá)高峰，F(xiàn)TY720干預(yù)組及CsA干預(yù)組尿蛋白雖較正常為高，但較模型組顯著下降，二者彼此間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；14周末時(shí)，F(xiàn)TY720干預(yù)組及CsA干預(yù)組尿蛋白均較模型小鼠明顯降低，與正常小鼠比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組小鼠血生化檢測(cè)血清TP、ALB、CHOL、Cr無(wú)顯著性意義。光鏡下觀察，F(xiàn)TY720干預(yù)小

18、鼠及CsA干預(yù)小鼠系膜區(qū)均可見(jiàn)IgA彌漫性沉積，染色程度較模型組明顯淺。病理上 FTY720干預(yù)小鼠及CsA干預(yù)小鼠均呈系膜增生性腎炎病變，以系膜基質(zhì)的輕度增生為主，其增生程度遠(yuǎn)較模型小鼠為輕。
　　 結(jié)論：FTY720同CsA一樣，對(duì)小鼠IgA腎病具有良好的治療效果。由于FTY720可誘導(dǎo)IgA+B淋巴細(xì)胞及IgA+漿細(xì)胞向Peyer小結(jié)歸巢，減少骨髓中漿細(xì)胞的數(shù)量，從而減少致病性IgA分子的產(chǎn)生，因此FTY720極有可能是一