1型鴨甲肝病毒3C基因第38位和144位氨基酸突變對(duì)病毒增殖及部分生物活性的影響.pdf

1、鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis,DVH）主要是由小RNA病毒科（Picornaviridae）禽肝病毒屬（Avihepatovirus）的鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV）所引起的一種病程短、高度致死的傳染性疾病。該病主要危害一月齡以內(nèi)的雛鴨，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。3C蛋白酶是小RNA病毒科病毒重要的蛋白酶之一，在病毒的復(fù)制過(guò)程中起到不可替代的作用。本研究利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的鴨

2、甲肝病毒1型（Duck hepatitis A virus type1,DHAV-1）DNA-Lanched傳染性克隆，通過(guò)PCR點(diǎn)突變的方法對(duì)3C基因的第38位和144位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，以研究突變后病毒的增殖能力及部分生物學(xué)活性的變化。本研究共分為三部分：
　　1、3C蛋白的原核表達(dá)及抗血清的制備
　　為了進(jìn)行DHAV-1傳染性克隆的I FA鑒定，本研究制備抗3C血清，首先將野生型3C基因及38位氨基酸突變基因3C38

3、，144位氨基酸突變基因3C144，以及38和144位氨基酸同時(shí)突變基因3C38+144四組基因分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX6P-1中，將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。將純化后的融合蛋白與弗氏完全佐劑混合，免疫 BALB/C小鼠，每只小鼠100μg。間隔兩周后，使用同一免蛋白量相同量的融合蛋白與弗氏不完全佐劑混合，進(jìn)行二免、三免和加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫結(jié)束后7天，小鼠眼球取血，離心后得

4、到四份抗血清，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)四組抗血清中3C38的血清效價(jià)最高。
　　2、3C突變基因傳染性克隆的構(gòu)建
　　參照實(shí)驗(yàn)室保存的DHAV-1傳染性克隆的序列和酶切圖譜設(shè)計(jì)引物，分別擴(kuò)增3C38、3C144、3C38+144和2C3A片段，通過(guò)引物將3C38、3C144、3C38+144與2C3A片段用EXTaq酶分別進(jìn)行PCR融合，得到2C3A3C38、2C3A3C144和2C3A3C38+144片段，并連接到pMD18-T

5、載體上，酶切鑒定得到陽(yáng)性質(zhì)粒，利用T載體通用引物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果分析表明除人工誘變的定點(diǎn)突變外，其余部分與母本病毒中的3C序列的同源性均為100％。
　　參考DHAV-1傳染性克隆的酶切圖譜，設(shè)計(jì)引物，將突變后的2C3A3C基因定向裝配到全基因組中。首先將得到的2C3A3C均與3D片段進(jìn)行融合，得到2C3A3C3D（文中簡(jiǎn)稱為CD）片段，利用全基因組中存在的EcoRV酶切位點(diǎn)，將其按順序裝配到全基因組中，獲得陽(yáng)性重組子 SR38、S

6、R144和 SR38+144，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)只有定點(diǎn)突變的3C基因中的第38位氨基酸和第144位氨基酸發(fā)生突變，其余的氨基酸均無(wú)突變。
　　將重組質(zhì)粒SR38、SR144和SR38+144轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，以母本SR質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌的PBS作陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后，BHK-21細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的CPE。將轉(zhuǎn)染后的四組細(xì)胞反復(fù)凍融后再次感染細(xì)胞，用熒光定量PCR和IFA方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。經(jīng)基因測(cè)序鑒定，表明病毒拯救成功。
　　

7、3、拯救病毒的增殖能力與部分生物學(xué)活性的檢測(cè)
　　重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞毒。用收集到的SR38、SR144和SR38+144三組拯救病毒與母本病毒再感染BHK-21細(xì)胞，并測(cè)定24h、36h、48h、60h和72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)病毒的拷貝數(shù)，繪制各病毒的生長(zhǎng)趨勢(shì)圖。病毒的生長(zhǎng)趨勢(shì)圖表明3C基因不同突變點(diǎn)的拯救病毒的增殖周期是不同的，并且病毒的最大拷貝數(shù)也是不同的，說(shuō)明3C基因中的第38位氨

8、基酸和第144位氨基酸的突變對(duì)病毒的增殖造成了一定的影響。
　　為了研究拯救病毒的生物活性的變化，本研究將65枚9日齡的健康鴨胚分成五組。其中第1組向尿囊液中接種300μL的無(wú)菌PBS，余下的2、3、4、5組分別接種同劑量的拯救病毒SR、SR38、SR144和SR38+144。按24h、48h、72h、96h和120h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察不同組鴨胚的臨床癥狀，并收集尿囊液，利用熒光定量 PCR檢測(cè)病毒在其中的增殖情況。結(jié)果表明拯救病毒與