豬流感病毒NS1蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞定位及細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、豬流感(swineinfluenza,SI)是由豬流感病毒(swineinfluenzavirus，SIV)引起的一種急性、傳染性和群發(fā)性呼吸道疾病。NS1(non-structural1)蛋白是病毒重要的調(diào)控蛋白，是病毒感染期間重要的毒力因子，通過多種機(jī)制抵抗宿主抗病毒應(yīng)答。對(duì)NS1蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白影響宿主免疫系統(tǒng)的功能，與NS1蛋白上的特定氨基酸位點(diǎn)密切相關(guān)。本研究擬對(duì)NS1關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，分析表達(dá)蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)干擾

2、素(IFN-α/β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的影響，進(jìn)一步明確NS1抑制干擾素產(chǎn)生機(jī)理，為防治豬流感提供理論依據(jù)。
　　研究擴(kuò)增了豬流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分離株NS1基因，克隆到pCAGGS表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCAGGS-NS1，經(jīng)PCR和酶切鑒定，獲得陽性克隆，序列分析表明NS1基因序列正確，無突變。設(shè)計(jì)引物，分別對(duì)42、92、42/92位氨基酸進(jìn)行突變，構(gòu)建了pCAGGS

3、-NS1S42P、pCAGGS-NS1D92E、pCAGGS-NS1S42P/D92E重組表達(dá)載體。提取pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1S42P、pCAGGS-NS1D92E、pCAGGS-NS1S42P/D92E質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染A549和293T細(xì)胞，經(jīng)Westernblot鑒定，NS1基因在A549和293T細(xì)胞中成功表達(dá)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，利用抗NS1多克隆抗體，進(jìn)行間接免疫熒光檢測，觀察不同重組表達(dá)蛋白的細(xì)胞定位情況

4、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞核中，少量分布在細(xì)胞質(zhì)中。NS1蛋白與NP蛋白之間的互作研究發(fā)現(xiàn)，在pCAGGS-NS1質(zhì)粒和pCAGGS-NP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中，NS1蛋白與NP蛋白存在結(jié)合.
　　提取經(jīng)Poly(I∶C)刺激的293T細(xì)胞總RNA，以β-actin為內(nèi)參照，建立檢測人源細(xì)胞IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA的半定量檢測方法，用來分析pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1S42P、pCA

5、GGS-NS1D92E、pCAGGS-NS1S42P/D92E重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA水平;同時(shí)用ELISA方法，檢測IFN-α/β和TNF-α在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果，pCAGGS-NS1S42P轉(zhuǎn)染組能夠明顯增強(qiáng)IFN-βmRNA轉(zhuǎn)錄水平，與pCAGGS-NS1組比較差異極顯著(P＜0.01)，IFN-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平差異顯著(0.01＜P＜0.05)，TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平與pCAGGS-

6、NS1轉(zhuǎn)染組相比差異不顯著(P＞0.05)。pCAGGS-NS1D92E和pCAGGS-NS1S42P/D92E轉(zhuǎn)染組與pCAGGS-NS1轉(zhuǎn)染組相比，IFN-α/β和TNF-αmRNA水平無明顯變化(P＞0.05)。ELISA檢測顯示，pCAGGS-NS1S42P轉(zhuǎn)染組能夠明顯增高IFN-β在細(xì)胞中的表達(dá)，與pCAGGS-NS1轉(zhuǎn)染組比較差異極顯著(P＜0.01)，IFN-α表達(dá)水平差異顯著(0.01＜P＜0.05);TNF-α表達(dá)水

7、平與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。pCAGGS-NS1D92E和pCAGGS-NS1S42P/D92E轉(zhuǎn)染組與pCAGGS-NS1轉(zhuǎn)染組相比，對(duì)IFN-α/β和TNF-α的表達(dá)水平差異不顯著(P＞0.05)。
　　目前發(fā)現(xiàn)NS1蛋白有兩種不同形式，為分析NS1蛋白差異是否影響感染細(xì)胞內(nèi)IFN-α/β和TNF-α的表達(dá)，研究選擇A/swine/Zhejiangi/1/2007株和A/swine/Shanghai/1/2007株，

8、NS1蛋白分別為219個(gè)氨基酸/24kD，230個(gè)氨基酸/26kD，分別感染293T細(xì)胞，ELISA檢測細(xì)胞因子表達(dá)差異。結(jié)果，兩株病毒感染組均能明顯增高IFN-α/3和TNF-α在細(xì)胞中的表達(dá)，與未感染組比較差異極顯著(P＜0.01)，但兩組之間差異不顯著(P＞0.05)。將兩株病毒分別免疫BALB/c小鼠，48h后用流式細(xì)胞儀檢測T淋巴細(xì)胞CD4+和CD8+水平。結(jié)果，與PBS組相比，病毒感染組能明顯提高CD4+T細(xì)胞亞群的百分率，