人副流感病毒3型HN蛋白十一肽重復(fù)序列保守氨基酸突變分析.pdf

1、背景:
　　人副流感病毒(humanparainfluenzaviruses，hPIVs)是屬于副粘病毒科的單負(fù)鏈RNA病毒，也是一類常見的社區(qū)獲得性呼吸道感染病原體。根據(jù)遺傳學(xué)和抗原性的不同，將hPIVs分為4個血清型及2個血清亞型(hPIV-1、2、3、4a、4b)，其中人副流感病毒3型(humanparainfluenzavirustype3，hPIV3)感染率高，持續(xù)時間長，主要引發(fā)六月齡以下嬰幼兒下呼吸道感染所致的細(xì)支氣

2、管炎和肺炎，是僅次于呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，RSV)的第二大病原體。迄今為止，hPIV3感染尚無有效的防治措施，各類疫苗也正處于研發(fā)攻堅階段，近年來取得了重要進展。然而，針對人體的安全有效的疫苗仍未問世，其主要障礙是對致病機制中病毒與靶細(xì)胞的融合機制尚未明確。
　　病毒包膜和靶細(xì)胞膜的融合是副粘病毒入侵和感染宿主細(xì)胞關(guān)鍵步驟。該過程是在附著蛋白的協(xié)助下，由同源性融合蛋白介導(dǎo)而發(fā)生的。根據(jù)

3、功能的不同，將副粘病毒附著蛋白分為HN、G、H三類，其中HN蛋白功能豐富，存在廣泛，受到研究者的普遍關(guān)注。HN蛋白以四聚體的形式存在于病毒包膜和宿主細(xì)胞膜上，主要功能有:①識別唾液酸受體并吸附于靶細(xì)胞膜表面;②發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)活性，促進子代病毒擴散;③特異性觸發(fā)同源F蛋白并使其發(fā)生一系列構(gòu)象改變，最終啟動膜融合。HN蛋白由頭部區(qū)、莖部區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)四部分組成，其中球狀頭部區(qū)主要負(fù)責(zé)結(jié)合受體和發(fā)揮N

4、A活性，已受到深入研究;而莖部區(qū)結(jié)構(gòu)及功能目前尚未明確，通常認(rèn)為其對HN蛋白低聚化和特異性觸發(fā)同源性F蛋白具有重要作用。
　　近期研究發(fā)現(xiàn)，大部分副粘病毒附著蛋白莖部區(qū)存在四螺旋束狀結(jié)構(gòu)(four-helixbundle，4HB)，其疏水性核心由11個重復(fù)的氨基酸序列(i，i+3，i+4，i+4)組成，更新了此前定義的七肽重復(fù)序列(i，i+3，i+4)模型的概念。同時，通過對比不同副粘病毒附著蛋白的十一肽重復(fù)序列可以發(fā)現(xiàn)，副粘病毒

5、莖部區(qū)疏水性氨基酸核心部分較為保守，對其進行突變可能影響HN蛋白正常的結(jié)構(gòu)和功能，為莖部關(guān)鍵氨基酸的定位提供了新的思路。迄今為止，尚未出現(xiàn)針對hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基酸的突變分析。
　　本研究將hPIV3HN作為研究對象，通過比對與其結(jié)構(gòu)高度相似的新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)HN蛋白及副流感病毒5型/猴副流感病毒(parainfluenzavirustype5，PIV5)HN蛋白

6、莖部十一肽重復(fù)區(qū)的氨基酸序列，確定了該區(qū)域存在的5個保守氨基酸位點，并將其突變?yōu)楸彼?。通過檢測突變體蛋白各活性的改變，明確hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點，分析其發(fā)生作用的原因，進一步加深對副粘病毒HN蛋白莖部區(qū)在融合機制中作用的理解。
　　目的:
　　1.確定hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基酸中起關(guān)鍵作用的位點。
　　2.分析并闡述關(guān)鍵氨基酸改變對HN蛋白結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響的原因。<

7、br>　　3.進一步理解HN蛋白莖部區(qū)在融合機制中的作用。
　　方法:
　　1.突變體的構(gòu)建:比對hPIV3、NDV、PIV5中HN蛋白的DNA序列，確定hPIV3HN莖部區(qū)十一肽重復(fù)序列中5個保守氨基酸I102、P111、L114、S119、I125，結(jié)合同源重組和定點突變技術(shù)，將其分別突變?yōu)楸彼帷?br>　　2.突變體的表達:利用陽離子轉(zhuǎn)染試劑TurboFectTMTransfectionReagent使待轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒

8、進入傳代乳鼠腎細(xì)胞（babyhamsterkidneycell，BHK-21）細(xì)胞，并通過痘苗病毒-T7瞬時表達系統(tǒng)將其表達。
　　3.促細(xì)胞融合活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒到BHK-21細(xì)胞，觀察合胞體形成情況。利用Giemsa染色定性觀察并記錄各突變體蛋白合胞體形成情況，利用指示基因法定量測定各突變體蛋白的促細(xì)胞融合活性。
　　4.受體識別活性的分析:分別轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN質(zhì)粒到

9、BHK-21細(xì)胞，利用血細(xì)胞吸附(hemadsorption，HAD)實驗檢測各突變體蛋白的受體識別活性。先定性觀察并記錄光學(xué)顯微鏡下新鮮人紅細(xì)胞(redbloodcell，RBC)吸附情況，再將已吸附的RBC裂解通過比色定量測定各突變體蛋白的受體識別活性。
　　5.神經(jīng)氨酸酶活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒，觀察合胞體形成情況。消化并裂解細(xì)胞后高速離心，利用神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒，通過酶促反應(yīng)檢測上

10、清中神經(jīng)氨酸酶的含量，以此定量測定各突變體蛋白的神經(jīng)氨酸酶活性。
　　6.半融合活性的分析:同時轉(zhuǎn)染突變體pBSK-HN及野生型pBSK-F質(zhì)粒，觀察合胞體形成情況。利用羅丹明B(octadecylrhodamineB，R18)熒光探針標(biāo)記新鮮RBC懸液，觀察半融合狀態(tài)下熒光探針由RBC表面轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞膜表面的現(xiàn)象，以研究突變體蛋白是否對膜融合的初始階段產(chǎn)生影響。
　　結(jié)果:
　　1.DNA測序結(jié)果表明，指定位點氨基酸

11、已分別突變?yōu)楸彼?，突變體質(zhì)粒I102A、P111A、L114A、S119A和I125A均構(gòu)建成功。
　　2.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A和I125A突變體蛋白的促細(xì)胞融合活性均發(fā)生不同程度下降，分別為野生型的6％、16％、14％、87％和4％;除S119A以外，其他突變體蛋白與野生型相比差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A和I1

12、25A的受體識別活性均發(fā)生不同程度下降，與野生型相比依次為32.2％、77.4％、74.2％、83.9％和38.7％，其中I102A及I125A的受體識別活性與野生型相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的神經(jīng)氨酸酶活性分別為野生型的66.5％、73.1％、69.1％、76.1％和72.8％，與野生型相比差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　5

13、.突變體蛋白I102A、P111A、L114A、S119A、I125A的半融合活性均發(fā)生下降，僅突變體蛋白S119A半融合活性較高，突變體蛋白I102A、P111A、L114A、I125A的半融合活性大幅度下降或基本喪失。
　　結(jié)論:
　　1.hPIV3HN中莖部十一肽重復(fù)序列對其促細(xì)胞融合活性和受體識別合活性具有重要意義。
　　2.明確了I102、P111、L114、I125在hPIV3HN莖部十一肽重復(fù)序列保守氨基