人工誘導(dǎo)花鰻鱺(Anguilla marmorata)卵巢發(fā)育成熟及相關(guān)基因不同時(shí)期表達(dá)定量的初步研究.pdf

1、花鰻鱺作為一種全世界廣泛分布的魚類，以其養(yǎng)殖性能優(yōu)良、營養(yǎng)食療價(jià)值高且味道鮮美而著稱，近年來成為廣為接受的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。但鰻鱺屬未解的生殖洄游生活史之謎以及復(fù)雜的生殖調(diào)控使得其人工繁育長期以來難以突破，只能依靠每年汛期來臨，漁民捕撈天然的新生玻璃鰻作為養(yǎng)殖苗種補(bǔ)充。再加上生態(tài)環(huán)境破壞和全球氣候改變，導(dǎo)致鰻苗資源總量逐年遞減，使得鰻鱺苗種的價(jià)格直接牽動(dòng)著整個(gè)鰻鱺產(chǎn)業(yè)的命脈，這大大限制了鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的推廣發(fā)展和鰻鱺物種保護(hù)活動(dòng)開展。因此

2、人工繁育鰻鱺研究變得尤為迫切與緊要。
　　本研究選取國家二級保護(hù)動(dòng)物花鰻鱺作為研究對象，通過綜合國內(nèi)外鰻鱺人工繁殖最新研究成果，進(jìn)行了不同激素誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育成熟的實(shí)驗(yàn)，并且使用 realtime-pcr技術(shù)對影響性腺發(fā)育的腦-腦垂體-性腺軸中與性腺發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行了定量研究，旨在優(yōu)化人工誘導(dǎo)花鰻鱺性腺成熟技術(shù)以及初步探究人工條件下誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育過程中的促性腺激素釋放素、促性腺激素及類固醇羥化酶P45011βh基因表達(dá)變化

3、趨勢和潛在作用。
　　主要從以下4個(gè)方面進(jìn)行了研究：
　　1、針對鰻鱺人工繁殖過程中催熟率低，卵質(zhì)發(fā)育不均勻，結(jié)合近年來國內(nèi)外研究成果，表明雄性激素對于鰻鱺卵巢發(fā)育早期的卵黃生成作用有明顯的促進(jìn)效果，從而設(shè)計(jì)不同激素來對花鰻鱺性腺進(jìn)行誘導(dǎo)性腺發(fā)育對比效果。結(jié)果表明：其中B組使用CPE和HCG共用能夠有效誘導(dǎo)花鰻鱺卵巢發(fā)育成熟，隨著誘導(dǎo)時(shí)間GSI（性腺指數(shù)）不斷增加，后期取樣卵巢GSI平均達(dá)22.9％，催熟效果顯著。而A、C、

4、D各組隨著注射激素誘導(dǎo)效果不明顯，GSI為1%-3%。特別是C組甚至表現(xiàn)出性腺退化現(xiàn)象，僅為0.5%。結(jié)果即通過使用ADSD對花鰻鱺進(jìn)行催熟并沒有明顯誘導(dǎo)效果，
　　2、通過使用B組成熟的雌魚和分段催熟的雄魚，使得雌雄魚達(dá)到共同成熟，為花鰻鱺繁殖技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了大量優(yōu)質(zhì)精子。隨后對鰻鱺雌雄魚進(jìn)行了催產(chǎn)，然而并未成功孵化得到花鰻鱺幼苗。我們在此基礎(chǔ)上通過觀察卵細(xì)胞形態(tài)以及回顧整個(gè)催產(chǎn)實(shí)驗(yàn)的過程，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，就如何把握最佳的催產(chǎn)時(shí)

5、機(jī)進(jìn)行了討論和總結(jié)，結(jié)論是花鰻鱺和日本鰻發(fā)育過程中存在一定的差異，只通過體重和形態(tài)觀察很容易錯(cuò)過最佳的催產(chǎn)時(shí)機(jī)，導(dǎo)致卵細(xì)胞過熟或者催產(chǎn)過早，應(yīng)該改進(jìn)檢察判斷方式，此實(shí)驗(yàn)為建立更加準(zhǔn)確實(shí)用的人工催產(chǎn)技術(shù)建立了基礎(chǔ)，為隨后的鰻鱺人工繁殖提供了第一手的實(shí)踐資料。
　　3、除此之外,我們采用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)對實(shí)驗(yàn)B組雌魚誘導(dǎo)期間不同時(shí)間段的腦垂體的促性腺激素亞基：GtHα、LHβ、以及 FSHβ基因進(jìn)行了定量研究，研究表明初步證明了

6、CPE和HCG一起使用能夠催熟花鰻鱺性腺發(fā)育的相關(guān)機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：LH在花鰻鱺性腺發(fā)育過程中扮演重要角色，隨著性腺發(fā)育 LH的表達(dá)量一直在增加。而 FSH的表達(dá)量則全部下調(diào)，表明其在花鰻鱺性腺發(fā)育成熟過程中作用不大。其中GtHα的上調(diào)也再次證明了促性腺激素在鰻鱺性腺發(fā)育過程中的重要性，而且從早期GtHα表達(dá)量上調(diào)明顯可以推測在性腺發(fā)育早期可能存在有甲狀腺激素等與FSH、LH存在共同α亞基的激素參與調(diào)控。
　　4、同時(shí)對B,C,

7、D組親魚全腦的促性腺激素釋放激素cGnRH II、mGnRH的前體進(jìn)行了基因表達(dá)的研究，初步論證 ADSD并未在宏觀上對花鰻鱺雌魚產(chǎn)生明顯誘導(dǎo)作用的原因，定量結(jié)果表明cGnRH II在最后成熟階段表達(dá)量似乎更高，這初步說明cGnRH II在繁殖后期過程中擔(dān)任了十分重要的角色，而mGnRH在整個(gè)誘導(dǎo)過程中也表現(xiàn)出了顯著高于對照組，對于性腺發(fā)育作用不可或缺。
　　為了進(jìn)一步探究 ADSD注射對花鰻鱺親魚類固醇生成作用產(chǎn)生了如何的內(nèi)在作

8、用，我們首次在前人基礎(chǔ)上克隆了花鰻鱺類固醇生成作用中P45011βcDNA片段，并且對其進(jìn)行了mRNA定量研究。整個(gè)繁殖過程中其表達(dá)豐度都較高,初步表明對于ADSD的注射對于花鰻鱺的P45011βH有顯著上調(diào)作用。但是與花鰻鱺卵巢發(fā)育并無直接關(guān)系，可能與其洄游啟動(dòng)，滲透壓調(diào)節(jié)存在一定關(guān)聯(lián)。其具體作用還有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，本文實(shí)踐并總結(jié)了花鰻鱺人工催熟催產(chǎn)過程中的關(guān)鍵點(diǎn)，并證明CPE與HCG共用可以有效催熟花鰻鱺卵巢和精

9、巢發(fā)育，并對催產(chǎn)過程中出現(xiàn)的問題進(jìn)行了深入討論。為鰻鱺人工繁殖研究提供了第一手資料；通過對誘導(dǎo)過程中促性腺激素亞基（GtHα, LHβ, FSHβ）、促性腺激素釋放素前體（cGnRH II, mGnRH）、類固醇生成酶P45011β等基因mRNA進(jìn)行了熒光定量pcr研究，初步證明了使用CPE和HCG花鰻鱺人工催熟過程中引起LH-βmRNA的上調(diào)是關(guān)鍵作用，F(xiàn)SHβmRNA表達(dá)量隨著卵巢發(fā)育過程不斷下調(diào)，作用不明顯，而cGnRH II和m