人工誘導花鰻鱺(Anguilla marmorata)卵巢發(fā)育成熟及相關基因不同時期表達定量的初步研究.pdf

1、花鰻鱺作為一種全世界廣泛分布的魚類，以其養(yǎng)殖性能優(yōu)良、營養(yǎng)食療價值高且味道鮮美而著稱，近年來成為廣為接受的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖對象。但鰻鱺屬未解的生殖洄游生活史之謎以及復雜的生殖調(diào)控使得其人工繁育長期以來難以突破，只能依靠每年汛期來臨，漁民捕撈天然的新生玻璃鰻作為養(yǎng)殖苗種補充。再加上生態(tài)環(huán)境破壞和全球氣候改變，導致鰻苗資源總量逐年遞減，使得鰻鱺苗種的價格直接牽動著整個鰻鱺產(chǎn)業(yè)的命脈，這大大限制了鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的推廣發(fā)展和鰻鱺物種保護活動開展。因此

2、人工繁育鰻鱺研究變得尤為迫切與緊要。
　　本研究選取國家二級保護動物花鰻鱺作為研究對象，通過綜合國內(nèi)外鰻鱺人工繁殖最新研究成果，進行了不同激素誘導花鰻鱺性腺發(fā)育成熟的實驗，并且使用 realtime-pcr技術對影響性腺發(fā)育的腦-腦垂體-性腺軸中與性腺發(fā)育相關的基因進行了定量研究，旨在優(yōu)化人工誘導花鰻鱺性腺成熟技術以及初步探究人工條件下誘導花鰻鱺性腺發(fā)育過程中的促性腺激素釋放素、促性腺激素及類固醇羥化酶P45011βh基因表達變化

3、趨勢和潛在作用。
　　主要從以下4個方面進行了研究：
　　1、針對鰻鱺人工繁殖過程中催熟率低，卵質(zhì)發(fā)育不均勻，結(jié)合近年來國內(nèi)外研究成果，表明雄性激素對于鰻鱺卵巢發(fā)育早期的卵黃生成作用有明顯的促進效果，從而設計不同激素來對花鰻鱺性腺進行誘導性腺發(fā)育對比效果。結(jié)果表明：其中B組使用CPE和HCG共用能夠有效誘導花鰻鱺卵巢發(fā)育成熟，隨著誘導時間GSI（性腺指數(shù)）不斷增加，后期取樣卵巢GSI平均達22.9％，催熟效果顯著。而A、C、

4、D各組隨著注射激素誘導效果不明顯，GSI為1%-3%。特別是C組甚至表現(xiàn)出性腺退化現(xiàn)象，僅為0.5%。結(jié)果即通過使用ADSD對花鰻鱺進行催熟并沒有明顯誘導效果，
　　2、通過使用B組成熟的雌魚和分段催熟的雄魚，使得雌雄魚達到共同成熟，為花鰻鱺繁殖技術進行了優(yōu)化，獲得了大量優(yōu)質(zhì)精子。隨后對鰻鱺雌雄魚進行了催產(chǎn)，然而并未成功孵化得到花鰻鱺幼苗。我們在此基礎上通過觀察卵細胞形態(tài)以及回顧整個催產(chǎn)實驗的過程，總結(jié)經(jīng)驗，就如何把握最佳的催產(chǎn)時

5、機進行了討論和總結(jié)，結(jié)論是花鰻鱺和日本鰻發(fā)育過程中存在一定的差異，只通過體重和形態(tài)觀察很容易錯過最佳的催產(chǎn)時機，導致卵細胞過熟或者催產(chǎn)過早，應該改進檢察判斷方式，此實驗為建立更加準確實用的人工催產(chǎn)技術建立了基礎，為隨后的鰻鱺人工繁殖提供了第一手的實踐資料。
　　3、除此之外,我們采用實時熒光定量pcr技術對實驗B組雌魚誘導期間不同時間段的腦垂體的促性腺激素亞基：GtHα、LHβ、以及 FSHβ基因進行了定量研究，研究表明初步證明了

6、CPE和HCG一起使用能夠催熟花鰻鱺性腺發(fā)育的相關機理，實驗結(jié)果表明：LH在花鰻鱺性腺發(fā)育過程中扮演重要角色，隨著性腺發(fā)育 LH的表達量一直在增加。而 FSH的表達量則全部下調(diào)，表明其在花鰻鱺性腺發(fā)育成熟過程中作用不大。其中GtHα的上調(diào)也再次證明了促性腺激素在鰻鱺性腺發(fā)育過程中的重要性，而且從早期GtHα表達量上調(diào)明顯可以推測在性腺發(fā)育早期可能存在有甲狀腺激素等與FSH、LH存在共同α亞基的激素參與調(diào)控。
　　4、同時對B,C,

7、D組親魚全腦的促性腺激素釋放激素cGnRH II、mGnRH的前體進行了基因表達的研究，初步論證 ADSD并未在宏觀上對花鰻鱺雌魚產(chǎn)生明顯誘導作用的原因，定量結(jié)果表明cGnRH II在最后成熟階段表達量似乎更高，這初步說明cGnRH II在繁殖后期過程中擔任了十分重要的角色，而mGnRH在整個誘導過程中也表現(xiàn)出了顯著高于對照組，對于性腺發(fā)育作用不可或缺。
　　為了進一步探究 ADSD注射對花鰻鱺親魚類固醇生成作用產(chǎn)生了如何的內(nèi)在作

8、用，我們首次在前人基礎上克隆了花鰻鱺類固醇生成作用中P45011βcDNA片段，并且對其進行了mRNA定量研究。整個繁殖過程中其表達豐度都較高,初步表明對于ADSD的注射對于花鰻鱺的P45011βH有顯著上調(diào)作用。但是與花鰻鱺卵巢發(fā)育并無直接關系，可能與其洄游啟動，滲透壓調(diào)節(jié)存在一定關聯(lián)。其具體作用還有待進一步研究。
　　綜上所述，本文實踐并總結(jié)了花鰻鱺人工催熟催產(chǎn)過程中的關鍵點，并證明CPE與HCG共用可以有效催熟花鰻鱺卵巢和精

9、巢發(fā)育，并對催產(chǎn)過程中出現(xiàn)的問題進行了深入討論。為鰻鱺人工繁殖研究提供了第一手資料；通過對誘導過程中促性腺激素亞基（GtHα, LHβ, FSHβ）、促性腺激素釋放素前體（cGnRH II, mGnRH）、類固醇生成酶P45011β等基因mRNA進行了熒光定量pcr研究，初步證明了使用CPE和HCG花鰻鱺人工催熟過程中引起LH-βmRNA的上調(diào)是關鍵作用，F(xiàn)SHβmRNA表達量隨著卵巢發(fā)育過程不斷下調(diào)，作用不明顯，而cGnRH II和m