酵母燃料乙醇生產(chǎn)相關(guān)基因SPT15基因工程改造研究.pdf

1、化石能源是當(dāng)今能源結(jié)構(gòu)的主體,卻是一類非常寶貴的不可再生資源。面對化石能源日益短缺及其燃燒產(chǎn)生的環(huán)境污染問題日益嚴重的現(xiàn)狀,人們開始尋找清潔可持續(xù)利用的替代能源。因此,開發(fā)和利用生物質(zhì)能源己成為一種戰(zhàn)略選擇。生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)中,目前規(guī)模方面發(fā)展最快的是燃料乙醇,但成本高昂是制約微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇工業(yè)的瓶頸。尤其是對于同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇,糖化和發(fā)酵時的最適溫度不協(xié)調(diào)以及乙醇的抑制作用是急待解決的問題。研究開發(fā)出適用于同步糖化發(fā)酵技術(shù)所需

2、高耐受性酵母菌株,就可以提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率、降低成本。因此,本論文針對與酵母中能耐受高濃度糖及高濃度乙醇的基因——轉(zhuǎn)錄因子SPT15進行基因工程改造,期望能獲得高耐受性酵母菌株。對SPT15進行了不同長度片段的隨機突變,并將產(chǎn)物連接到含有半乳糖啟動子的酵母穿梭載體質(zhì)粒PYES2(多拷貝質(zhì)粒)和PGAL1-Ycplac22(單拷貝質(zhì)粒)中,使突變基因能被誘導(dǎo)過量表達。隨機突變采用在標(biāo)準PCR反應(yīng)體系中加入Mn2+的方式,通過對不同片段

3、長度的SPT15基因隨機突變的體系進行的系統(tǒng)研究,我們發(fā)現(xiàn)大于500bp長度的DNA隨著Mn2+濃度的提高,突變率迅速上升,而小于250 bp短片段的DNA對Mn2+濃度不特別敏感,從而進一步確定了對1000 bp長度以內(nèi)不同長度片斷單突變或多突變所適合的Mn2+濃度。同時,在建立突變體庫的過程中,對大腸桿菌電轉(zhuǎn)化條件進行了摸索,確定了電轉(zhuǎn)化的最佳方式。本文構(gòu)建的SPT15突變體庫為進一步篩選高耐受酵母菌創(chuàng)造了條件,為酵母基因工程改造提