先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎病因?qū)W研究——腸屏障機(jī)制及高危因素分析.pdf

1、目的:
　　 小腸結(jié)腸炎(enterocolitis,EC)是先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung'sdisease,HD)最常見的并發(fā)癥,發(fā)病率約20％～58％,死亡率1％～30％,平均治療費(fèi)用是非腸炎性先天性巨結(jié)腸的2.5倍。先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎(Hirschsprung’s associated enterocolitis,HAEC)的復(fù)雜發(fā)病機(jī)制仍不清楚,越來越多的臨床證據(jù)顯示HAEC的發(fā)生不僅僅是由于功能性梗阻造成

2、的慢性擴(kuò)張所引起,先天性巨結(jié)腸患者本身可能存在某種缺陷。腸炎的發(fā)生是腸屏障功能失衡的結(jié)果,腸粘膜機(jī)械屏障中的緊密連接復(fù)合體及免疫屏障中CD4+、CD8+T細(xì)胞的狀態(tài)與腸炎的發(fā)生密切相關(guān)。本研究擬從先天性巨結(jié)腸腸粘膜中構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)的Occludin和ZO-1蛋白以及構(gòu)成免疫屏障中重要防線的CD4+、CD8+T細(xì)胞出發(fā),并調(diào)查分析小腸結(jié)腸炎發(fā)生的臨床相關(guān)高危因素,以探索其內(nèi)在的可能發(fā)病機(jī)制,為小腸結(jié)腸炎的防治提供新的理論依據(jù)。

3、
　　 對象和方法:
　　 1.選取2004年1月至2005年12月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)中切除的狹窄段和擴(kuò)張段腸管粘膜層標(biāo)本,共30例,根據(jù)術(shù)前有無小腸結(jié)腸炎臨床癥狀分為HD小腸結(jié)腸炎組和HD非腸炎組。并選取正常對照組10例。分別采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡技術(shù),觀察不同組腸粘膜內(nèi)Occludin和ZO-1的分布及蛋白表達(dá)量,并通過透射電鏡技術(shù)了解不同組腸粘膜緊密連接的超微結(jié)構(gòu)。同時采用原位

4、雜交技術(shù)了解不同組粘膜內(nèi)nNOS與iNOSmRNA的表達(dá)量。
　　 2.選取行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)中切除的腸管粘膜層標(biāo)本,共18例,術(shù)前均無腸炎發(fā)生。利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對6個不同部位的結(jié)腸粘膜中Occludin、ZO-1、nNOS及iNOS基因表達(dá)量進(jìn)行檢測,并比較Occludin、ZO-1與nNOS之間是否存在相關(guān)關(guān)系。
　　 3.選取行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)中切除的腸管粘膜層標(biāo)本,共20例,術(shù)前均無腸炎發(fā)生。按年齡

5、分=3月和>3月兩組,每組10例。另取正常對照組5例。采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分別對先天性巨結(jié)腸狹窄段、擴(kuò)張段及對照組粘膜層中CD4+、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較三組間是否存在差異。
　　 4.選取行先天性巨結(jié)腸根治術(shù)中切除的腸管14例,根據(jù)術(shù)前有無小腸結(jié)腸炎臨床癥狀將HD患兒分為HD小腸結(jié)腸炎組和HD非腸炎組,每組7例,分別利用免疫組織化學(xué)技術(shù)及流式細(xì)胞儀技術(shù)對狹窄段和擴(kuò)張段肌層中的巨噬細(xì)胞及腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(i

6、nterstitial cells of Cajal,ICC)進(jìn)行染色及計(jì)數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較兩組間是否存在差異。
　　 5.對297例先天性巨結(jié)腸患兒的病史資料進(jìn)行回顧性分析,分別對巨結(jié)腸根治術(shù)前及根治術(shù)后小腸結(jié)腸炎發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行調(diào)查,按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)賦值,分別以術(shù)前腸炎和術(shù)后腸炎作為因變量,以調(diào)查表中其它因素為自變量進(jìn)行Logistic回歸,尋找對腸炎具有獨(dú)立影響的因素。
　　 6.利用Meta分析對1980年1

7、月至2006年3月國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)期刊發(fā)表的有關(guān)先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎發(fā)生影響因素的臨床研究文獻(xiàn)結(jié)果進(jìn)行回顧和綜合性統(tǒng)計(jì)研究,從中確定先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎發(fā)生的可能危險(xiǎn)因素。
　　 結(jié)果
　　 1.先天性巨結(jié)腸腸炎組和非腸炎組的狹窄段ZO-1及Occludin蛋白均顯著少于擴(kuò)張段和對照組；在擴(kuò)張段,非腸炎組Occludin和ZO-1蛋白與正常對照組相比沒有顯著性差異；腸炎組的Occludin和ZO-1蛋白則顯著少于對照組

8、和非腸炎組擴(kuò)張段。狹窄段nNOS明顯減少,腸炎組與非腸炎組則無明顯差別。iNOS在先天性巨結(jié)腸腸炎組顯著增多,狹窄段與擴(kuò)張段沒有差別。
　　 2.先天性巨結(jié)腸狹窄段至擴(kuò)張段ZO-1、Occludin、nNOSmRNA表達(dá)量呈逐漸上調(diào)趨勢,iNOSmRNA表達(dá)量無明顯改變。ZO-1、Occludin基因mRNA的表達(dá)分別與nNOS存在相關(guān)關(guān)系(r=0.902,r=0.804)。
　　 3.在先天性巨結(jié)腸及正常對照組中,=3

9、月組結(jié)腸粘膜內(nèi)CD4+、CD8+均低于>3月組；在=3月組內(nèi),HD患兒的腸粘膜內(nèi)CD4+、CD8+顯著低于對照組(P=0.000,P=0.013)。>3月組內(nèi),HD患兒的腸粘膜內(nèi)CD4+、CD8+與對照組相比,無顯著性差異(P=0.528,P=0.871),
　　 4.免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)顯示先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸管中CD68+巨噬細(xì)胞較非腸炎組明顯增多,CD117+ICC較非腸炎組顯著減少。
　

10、　 5.297例先天性巨結(jié)腸根治術(shù)前小腸結(jié)腸炎影響因素按照影響程度大小程度依次為小于3月患兒、輔助排便方式、喂養(yǎng)方式；220例先天性巨結(jié)腸根治術(shù)小腸結(jié)腸炎影響因素按照影響程度大小程度依次為:術(shù)后IND、術(shù)前腸炎、術(shù)后吻合口狹窄、近端腸管炎性程度、吻合口瘺腹腔感染。
　　 6.Meta分析篩選23篇相關(guān)文獻(xiàn),綜合3543例先天性巨結(jié)腸患兒,1085例HAEC,發(fā)現(xiàn)Down’s綜合癥、全結(jié)腸型小腸結(jié)腸炎、IND、術(shù)前腸炎、吻合口狹

11、窄是小腸結(jié)腸炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素；而性別、新生兒期HD、分期手術(shù)并不能增加小腸結(jié)腸炎發(fā)生的危險(xiǎn)性。
　　 結(jié)論
　　 1.先天性巨結(jié)腸狹窄段粘膜中緊密連接蛋白分子Occludin、ZO-1蛋白的分布異常、表達(dá)量降低是導(dǎo)致其易合并小腸結(jié)腸炎的可能因素。
　　 2.先天性巨結(jié)腸腸粘膜中緊密連接蛋白分子Occludin、ZO-1基因的表達(dá)與nNOS基因的表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系,狹窄段和移行段中nNOS表達(dá)降低是導(dǎo)致其粘膜中緊密連

12、接蛋白分子Occludin、ZO-1基因表達(dá)下降的可能因素。
　　 3.結(jié)腸粘膜中先天性巨結(jié)腸CD4+、CD8+T細(xì)胞有逐漸成熟增殖的過程,先天性巨結(jié)腸狹窄段中CD4+、CD8+T細(xì)胞發(fā)育延遲可能是小嬰兒期先天性巨結(jié)腸易并發(fā)小腸結(jié)腸炎的內(nèi)在因素之一。
　　 4.先天性巨結(jié)腸小腸結(jié)腸炎有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段巨噬細(xì)胞增多及腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞減少,是小腸結(jié)腸炎患兒巨結(jié)腸根治術(shù)后易出現(xiàn)腸功能不良或腸炎復(fù)發(fā)的可能因?yàn)椤?br>　　 5