肌-眼-腦病病理生理機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：肌-眼-腦病是一種常染色體隱性遺傳性疾病，為編碼N-乙酰氨基葡萄糖-氧位-甘露糖轉(zhuǎn)移酶 1(protein-O-linked manrloseβ1，2-N-acetylglucosaminyl -transferase1，POMGnT1)的基因缺陷，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的肌營(yíng)養(yǎng)不良、眼缺陷以及智力障礙。為了闡明該病的病理生理機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了許多研究，發(fā)現(xiàn)患者或者動(dòng)物模型的腦內(nèi)存在神經(jīng)元遷移異常。然而，迄今為止，神經(jīng)元遷移異常是如何發(fā)生的、

2、生物體內(nèi)還有哪些繼發(fā)變化等問(wèn)題還沒(méi)有得到解決。 目的： 探討肌-眼-腦病的病理生理機(jī)制，了解該病神經(jīng)元遷移缺陷的發(fā)生過(guò)程以及基因表達(dá)譜的變化。 方法： 1．產(chǎn)生POMGnT-1 基因敲除小鼠并確定基因型，以同一窩的野生型小鼠作為正常對(duì)照。 2．應(yīng)用免疫熒光染色的方法顯示小腦基底膜層、膠質(zhì)細(xì)胞界膜和顆粒細(xì)胞的發(fā)育；免疫熒光雙標(biāo)染色的方法顯示Laminin和膠質(zhì)細(xì)胞酸性蛋白之間的關(guān)系；應(yīng)用高爾基染色顯

3、示小腦的細(xì)胞形態(tài)。 3．進(jìn)行BrdU皮下注射，免疫標(biāo)記識(shí)別 S 期的分裂細(xì)胞，進(jìn)行出生后日期計(jì)數(shù)。 4．應(yīng)用電鏡分析來(lái)檢查軟腦膜基底膜層的完整性和顆粒細(xì)胞的分化情況。 5．應(yīng)用 YFPH 小鼠顯示由黃色熒光蛋白標(biāo)記的苔蘚纖維。 6.分離小腦皮質(zhì)，提取mRNA。 7.利用Affymetrix公司的基因芯片，獲取 POMGnT-1 基因敲除小鼠小腦皮質(zhì)的基因差異表達(dá)譜，通過(guò)該公司的信息分析中心，進(jìn)一步

4、分析微陣列信息。 8.合成cDNA，行實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)微陣列數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1.POMGnT-1 基因敲除小鼠的軟腦膜基底膜層局灶的缺口和膠質(zhì)細(xì)胞界膜的破壞與外生發(fā)層的細(xì)胞異位明確相關(guān)。Bergman 膠質(zhì)細(xì)胞的纖維回縮、紊亂、或突出到異位區(qū)域，缺乏正常的 Bergman 膠質(zhì)細(xì)胞纖維的腳手架是導(dǎo)致神經(jīng)元遷移失敗的原因。不過(guò)，異位的 EGL 細(xì)胞可以發(fā)育成成熟的顆粒細(xì)胞，并與苔蘚纖維形成突觸。 2.和野

5、生型相比較，POMGnT-1缺陷小鼠的大多數(shù)的基因的表達(dá)水平增加。在這些基因中，S100 鈣結(jié)合蛋白、酪氨酸羥化酶、小腦鋅指樣蛋白、calbindin 2、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白增加的 fold 數(shù)較高，分別為27.39、13.97、13.94、11.64、11.00；僅有少數(shù)的幾個(gè)基因的表達(dá)水平下降，分別為神經(jīng)絲3-M、POMGnT-1和一個(gè)編碼未知蛋白的基因。表達(dá)變化的基因分成轉(zhuǎn)錄、代謝、發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、遷移、糖基化等組，其中，轉(zhuǎn)錄、代謝、