南海石頭魚(yú)毒素的分離純化、毒性測(cè)定、分子克隆及原核表達(dá)研究.pdf

1、石頭魚(yú)生活在印度洋和太平洋的熱帶及亞熱帶淺水區(qū)域，是世界上毒性最強(qiáng)的魚(yú)。其毒液可以引起一系列中毒癥狀，如劇痛、水腫、肌肉麻痹、低血壓等。目前已在石頭魚(yú)粗毒液中分離出毒素neoVTX。中國(guó)海域的石頭魚(yú)為玫瑰毒鲉,主要分布于南海海域。
　　目的：獲得南海石頭魚(yú)毒素的毒性狀況、組分的蛋白質(zhì)序列及蛋白質(zhì)表達(dá)方法，為其抗毒素的制備及石頭魚(yú)刺傷的防治奠定基礎(chǔ)。
　　方法：提取南海石頭魚(yú)的粗毒液,利用SDS-PAGE及MS鑒定粗毒液的主要

2、成分，再用GF-HPLC小量分離粗毒液的主要成分，然后用AKTA蛋白質(zhì)分離系統(tǒng)對(duì)粗毒液進(jìn)行大量分離，并測(cè)定粗毒液及其分離組分的LD50；分離石頭魚(yú)毒囊組織,提取石頭魚(yú)毒囊RNA,運(yùn)用RACE技術(shù),獲得毒素的cDNA全序列，連入pET-22b(+)中，進(jìn)行原核表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.在粗毒液的電泳條帶中，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)已知蛋白質(zhì)和4個(gè)未知蛋白質(zhì)。其中2個(gè)已知蛋白質(zhì)被鑒定為已報(bào)道的neoVTXα、β亞基；4個(gè)未知蛋白質(zhì)中，有2個(gè)

3、蛋白質(zhì)與已報(bào)道的neoVTXβ條帶有最高匹配度；另有2個(gè)分別與β微管蛋白，3-磷酸甘油醛脫氫酶匹配度最高；
　　2.對(duì)粗毒液進(jìn)行 GF-HPLC分離后，發(fā)現(xiàn)了5種尚未報(bào)道的分子量約為14KD的小分子蛋白質(zhì)；
　　3.粗毒液對(duì)小鼠的LD50（i.v.）為106ng/g，neoVTX對(duì)小鼠的LD50（i.v.）為66ng/g，分子量約為14KD的小分子蛋白質(zhì)在278ng/g時(shí)，對(duì)小鼠完全沒(méi)有中毒癥狀及致死性；
　　4.成功

4、克隆了neoVTXα和β亞基的cDNA序列，與沖繩海域玫瑰毒鲉的neoVTXα和β的cDNA序列均具有高達(dá)99％的序列同源性；
　　5.以pET-22b(+)為表達(dá)載體，Rosetta感受態(tài)細(xì)胞為宿主，對(duì)neoVTXα和β亞基進(jìn)行原核表達(dá)，成功表達(dá)了neoVTXα，產(chǎn)率為0.45mg/L；β亞基未能成功表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.玫瑰毒鲉粗毒液的成分除 neoVTX外，還有至少3類(lèi)蛋白質(zhì)：第1類(lèi)是與neoVTXβ有較高