VEGF和HO-1聯(lián)合應(yīng)用提高超長隨意皮瓣末端存活率的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨意皮瓣是修復(fù)創(chuàng)面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。但臨床應(yīng)用時(shí)往往受到嚴(yán)格的長寬比例的限制。臨床上超過一定長寬比例的皮瓣遠(yuǎn)端常發(fā)生缺血壞死，目前尚無公認(rèn)的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功與兩個(gè)因素有關(guān)：一是蒂部及血管網(wǎng)的血供營養(yǎng)，二是皮瓣基底及周邊組織床新生微血管的及時(shí)長入。因此在蒂部血流一定的條件下，如何促進(jìn)血管新生成為提高皮瓣存活面積一個(gè)關(guān)鍵因素。新生血管的及時(shí)形成對皮瓣的成活起著很重要的作用，如果阻斷皮瓣與受床之間血運(yùn)的建立，

2、皮瓣的成活面積將減少。皮瓣遠(yuǎn)端缺血部分的成活過程與皮片相同，主要通過與受床間建立血運(yùn)再血管化而成活。在目前眾多的研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種有效的促血管新生因子，它能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和增加血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性促進(jìn)血管生成，誘導(dǎo)NO的生成[1]，進(jìn)而起到促進(jìn)組織愈合的作用。VEGF有良好的生物學(xué)作用已經(jīng)得到認(rèn)可，很多學(xué)者也嘗試了用各種不同的方法和途徑通過外源性的VEGF作為補(bǔ)充來促進(jìn)皮瓣的成活。組織在缺血后發(fā)生一系列

3、的生物反應(yīng)，組織的缺血引起VEGF濃度的升高，改變皮瓣的灌注，從而引起血管的舒張和新生血管的形成[2，3]。然而，由于皮瓣遠(yuǎn)端組織長時(shí)間嚴(yán)重的缺氧、缺血會使微血管及內(nèi)皮細(xì)胞會受到直接損傷，使得內(nèi)源性的VEGF來不及分泌，或在外源性的VEGF補(bǔ)充后遠(yuǎn)端組織的新生血管不能及時(shí)長入而導(dǎo)致壞死。在缺血后3h，我們就可以檢測到VEGF受體VEGFR-2的表達(dá)，而在18h后就會發(fā)生衰減[4]。因此，我們在本實(shí)驗(yàn)中在使用VEGF的同時(shí)，聯(lián)合引進(jìn)了具有

4、抗氧化，抗炎癥，抗凋亡，可以提高機(jī)體抗缺氧能力的血紅素氧化酶(HO-1)[5]。此酶能夠延長隨意皮瓣遠(yuǎn)端組織的抗缺氧時(shí)間，為VEGF促進(jìn)新生血管的長入贏得了更加充足的時(shí)間，從而提高超長隨意皮瓣遠(yuǎn)端組織的存活面積。 HO-1是血紅素代謝的起始限速酶，主要存在于細(xì)胞微粒體中。它能夠?qū)⒀t素分解為膽綠素、一氧化碳和鐵[6，7]，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下進(jìn)一步生成膽紅素。膽紅素和膽綠素能有效的清除氧自由基，有較強(qiáng)的抗氧化功能。在許

5、多因素作用下能誘導(dǎo)產(chǎn)生HO-1表達(dá)，是細(xì)胞在缺血再灌注[8]、低氧損傷、內(nèi)毒素血癥[9]、組織排異[10]等應(yīng)激過程中的一種自我保護(hù)機(jī)制。Bussolati等[11]提出VEGF誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，提高了HO-1在人內(nèi)皮細(xì)胞中的活性。HO-1抑制劑能夠消除VEGF在體內(nèi)非炎癥的促血管新生反應(yīng)。先前的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HO-1能誘導(dǎo)VEGF的分泌，HO-1的大量表達(dá)會引起毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的增殖和形成[12，13]。Soares等[14]研究發(fā)現(xiàn)

6、，VEGF和HO-1的表達(dá)會激發(fā)一個(gè)正反饋環(huán)的形成，即VEGF可以上調(diào)HO-1的表達(dá)，反之亦然。 基因表達(dá)載體有病毒表達(dá)載體和非病毒表達(dá)載體。病毒表達(dá)載體有RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒、DNA腺病毒和DNA腺相關(guān)病毒( AAY)等；而非病毒表達(dá)載體有質(zhì)粒、脂質(zhì)體、裸DNA和基因槍等。目前被研究應(yīng)用最多也最方便的是腺病毒載體。腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)有①宿主范圍廣，對人致病性低；②在增殖和非增殖細(xì)胞中感染和表達(dá)基因；⑧能有效進(jìn)行增殖，滴度高；④不整合

7、到染色體中，無插入致突變性；⑤能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等。正是由于具有以上一些優(yōu)點(diǎn)，腺病毒被極其廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個(gè)領(lǐng)域。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們將VEGF和HO-1有機(jī)的結(jié)合在一起，使其兩者發(fā)揮更大的生物學(xué)效應(yīng)。并以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，使其能持續(xù)表達(dá)目的蛋白，有助于克服傳統(tǒng)的生物制劑半衰期短，活性低，成本高等缺點(diǎn)。以腺病毒在載體聯(lián)合應(yīng)用VEGF和HO-1能否提高隨意皮瓣遠(yuǎn)端組織的成活面積，目前國內(nèi)外未

8、見相關(guān)報(bào)道。為此，我們設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)課題，進(jìn)行了以下三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)研究。 1．Ad5-VEGF和Ad5-HO-1非增殖腺病毒的構(gòu)建與制備 目的：構(gòu)建含人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF165)和血紅素氧合酶(HO-1)的重組腺病毒載體(Ad-VEGF165和Ad-HO-1)，為后續(xù)的基因轉(zhuǎn)染、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：引物合成后獲取目的基因，將質(zhì)粒PDC315-VEGF和PSUCMV-HO-1與含有5型腺病毒右臂

9、的質(zhì)粒pBHGE3通過Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，提取腺病毒DNA并應(yīng)用PCR進(jìn)行鑒定。將重組出的病毒在293細(xì)胞中反復(fù)大量擴(kuò)增，通過氯化銫密度梯度離心法進(jìn)行純化，并用TCID50法計(jì)算病毒滴度。 結(jié)果：經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為Ad-VEGF165和Ad-HO-1。測得重組腺病毒Ad-VEGF滴度為1×10m pfu/ml，病毒Ad-Ho-1滴度為7

10、.5×109 pfu/ml。結(jié)論：成功構(gòu)建了復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-VEGF165和Ad-HO-1，其滴度高，毒性低，可用于體外轉(zhuǎn)染。 2．腺病毒Ad-VEGF和Ad-HO的體外實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討重組腺病毒Ad-VEGF165和Ad-HO-1轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞BJ后目的蛋白的表達(dá)情況和對BJ細(xì)胞生長、增殖分化的影響。 方法：用報(bào)告基因Ad-EGFP轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，觀察其在熒光顯微鏡下的熒光強(qiáng)度和流式細(xì)胞儀來檢測腺病毒

11、的轉(zhuǎn)染效率和強(qiáng)度。用ELISA的方法檢測Ad-VEGF165在BJ細(xì)胞中定量表達(dá)，用免疫組化和WESTERN BLOT檢測Ad-HO-1在BJ細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。MTT檢測腺病毒對BJ細(xì)胞增殖活性的影響。 結(jié)果：腺病毒介導(dǎo)的目的基因?qū)J細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，隨著MOI的增強(qiáng)效率增高，具有量效關(guān)系。ELISA可以檢測到VEGF的有效表達(dá)，同時(shí)免疫組化和WESTERN BLDT也檢測到了Ad-HO-1在BJ細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染

12、一周后MTT檢測OD值，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OD值無顯著性差異。 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的VEGF165和HO-1能在BJ細(xì)胞中有效表達(dá)，并且不會對BJ細(xì)胞的增殖活性產(chǎn)生影響。 3．Ad-VEGF和Ad-HO聯(lián)合應(yīng)用提高大鼠超長皮瓣存活率的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究 目的：探討腺病毒介導(dǎo)的VEGF165和HO-1聯(lián)合應(yīng)用能否提高大鼠超長隨意皮瓣遠(yuǎn)端組織的成活面積。 方法：以SD大鼠背部兩側(cè)超長隨意皮瓣為模型[15]。將

13、動物隨機(jī)分為5組：Ad-VEGF165+Ad-HO-1(A組)、Ad-VEGF165(B組)、Ad-HO-1(C組)、Ad-GFP(D組)、病毒保存液Ad-buffer(E組)。分別在掀起皮瓣深筋膜層分10小部分注射。術(shù)后一周采用頸椎脫臼法處死。觀察各個(gè)皮瓣的大體情況，存活面積，常規(guī)病理切片HE染色，皮瓣組織的VEGF和HO-1免疫組化檢測，CD31免疫組化和皮瓣新生微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：大體解剖及病

14、理切片顯示：Ad-VEGF165+Ad-HO-1聯(lián)合應(yīng)用組皮瓣的成活面積及血管化程度明顯高于其他四組，B組稍高于C、D、E三組，C、D、E三組之間無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的VEGF165和HO-1聯(lián)合應(yīng)用能夠提高大鼠超長隨意皮瓣遠(yuǎn)端組織的成活面積，降低皮瓣覆蓋創(chuàng)面的風(fēng)險(xiǎn)。 綜上所述，我們構(gòu)建了攜帶VEGF165和HO-1目的基因的非增殖腺病毒Ad-VEGF165和Ad-HO-1，其對提高大鼠超長隨意