VEGF和HO-1轉染EPC治療大鼠后肢缺血的研究.pdf

1、目前下肢缺血性疾病已經(jīng)成為危害人類健康的嚴重疾病之一，針對該疾病的主要治療手段有藥物、外科手術和血管腔內(nèi)治療等。但是對于遠端流出道嚴重狹窄的患者目前還缺乏令人滿意的治療方法。應用各種方法和手段促進新生血管生成，加快缺血肢體側枝循環(huán)的建立，是有效可行的研究方向之一。 內(nèi)皮祖細胞(EPCs)是在特定條件下可以分化成血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有促進機體血管生成的功能。1997年，Asahara等從外周血中分離出CD34+細胞，在體外將

2、其誘導分化成內(nèi)皮細胞，植入動物后肢缺血模型中局部形成新生血管。因而獲取EPCs并誘導分化，移植到缺血部位形成新生血管，治療缺血性疾病如心肌梗死、動脈硬化閉塞癥、糖尿病足等引起了人們的廣泛興趣。由于EPCs在體內(nèi)數(shù)量有限，所以如何減少EPCs用量，獲得更好的臨床效果成為目前研究的重點。 研究表明結合基因治療是解決這一問題的出路。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在治療缺血性疾病中的作用已經(jīng)得到肯定，它能增加小血管的通透性、促進內(nèi)皮細胞增

3、殖和遷移，抑制內(nèi)皮細胞凋亡，并能刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生纖溶酶原激活物，從而有力地促進血管新生。近年來血紅素氧合酶-1(HO-1)在血管系統(tǒng)中的作用逐漸被人們所重視，并已成為目前相關領域研究的熱點，HO-1蛋白在降低機體缺血時的損傷有重要作用，HO-1可催化血紅素形成膽綠素(膽綠素快速還原為膽紅素)，釋放鐵和一氧化碳(CO)，是血紅素代謝的限速酶。CO具有調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集和抗心肌缺血再灌注損傷等效應，膽綠素進一步經(jīng)膽綠素還原酶作用生

4、成膽紅素，其抗氧化能力甚至超過了維生素E和維生素C，能清除體內(nèi)過量的自由基，保護細胞對抗氧化應激的損傷作用，HO-1降解血紅素形成的鐵離子還能誘導鐵蛋白的合成，鐵蛋白亦有抗氧化損傷和細胞保護功能。HO-1及其酶解產(chǎn)物一起組成強大的內(nèi)源性保護系統(tǒng)，在防治多種心血管疾病中均發(fā)揮著積極的作用。近年來在轉基因方面取得的進步也表明HO-1是基本的內(nèi)源性細胞防御系統(tǒng)，具有保持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、抗氧化的作用，Melo等發(fā)現(xiàn)轉染HO-1基因可使結扎冠狀動

5、脈后的左室心梗面積縮小75％以上，顯示HO-1具有抗心肌缺血壞死的功能。同時其他實驗表明HO-1還可促進血管內(nèi)皮細胞增生，對血管損傷修復有重要作用。 本研究從大鼠骨髓細胞中利用VEGF成功誘導分化成EPCs，并將鼠VEGF和HO-1基因轉入EPCs，比較單用EPCs、轉染VEGF的EPCs、轉染HO-1的EPCs和聯(lián)合使用轉染VEGF和HO-1的EPCs治療缺血大鼠后肢的效果： 目的：使用VEGF和HO-1轉染EPCs治

6、療大鼠缺血后肢，了解EPCS、VEGF轉染EPCS、HO-1轉染EPCS及聯(lián)合使用VEGF和HO-1轉染EPCS對大鼠缺血后肢的新生血管和肢體成活的影響，旨在為臨床基因與干細胞的治療應用提供依據(jù)。 方法：制作90只SD大鼠后肢缺血模型，將動物隨機分為五組，PBS組術后即經(jīng)鼠尾靜脈注射PBS0.2 ml；EPC組術后即經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml；VEGF+EPC組即經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×1

7、05個細胞經(jīng)VEGF基因轉染)；HO-1+EPC組經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×105個細胞經(jīng)HO-1基因轉染)；VEGF+HO-1+EPC組經(jīng)鼠尾靜脈注射EPCs懸液0.2 ml(其中2.5×105個細胞經(jīng)VEGF基因轉染，2.5×105個細胞經(jīng)HO-1基因轉染)。分別于術后7、14及21d進行有關指標的觀察與檢測。觀察轉染VEGF、HO-1基因的EPCs在缺血部位的聚集和促進新生血管形成的情況。 結果：

8、1)用密度梯度離心和貼壁法結合VEGF細胞因子體外培養(yǎng)的骨髓來源的EPCs為CD133、CD34陽性細胞，表達VEGFR—2，F(xiàn)ITC—UEA-1雙熒光染色陽性；2)鼠VEGF、HO-1基因測序鑒定結果分別與參考序列NM_031836和NM012580一致，并成功轉染入EPCs；3)動物總殘肢率比較，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組較PBS組明顯增加的肢體恢復率(P<0.05)，其中VEGF組和HO-1組之間差異無統(tǒng)計學意義(P

9、>0.05)；VEGF+HO-1組肢體恢復率優(yōu)于VEGF組和HO-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4)毛細血管密度(MVD)與PBS組相比，各時間點中EPC、VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組MVD均明顯增多(P<0.05)，手術后14d和21d，VEGF+HO-1組MVD多于VEGF組和HO-1組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)：5)缺血肢體VEGF，HO-1的表達：VEGF組的VEGF蛋白表達較PBS組、EPC組、H

10、O-1組明顯增多，與VEGF+HO-1組差異無統(tǒng)計學意義；HO-1組的HO-1蛋白表達較PBS組、EPC組、VEGF組明顯增多，與VEGF+HO-1組差異無統(tǒng)計學意義；6)手術后7d，所有組的小鼠肢體灌注都降低：手術后14，21d，與PBS對照組相比，VEGF、HO-1和VEGF+HO-1組的血流灌注恢復明顯(P<0.01)，EPC組血流灌注較VEGF組和HO-1組少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；VEGF+HO-1組血流灌注多于V