VEGF轉(zhuǎn)染NSCs治療新生腦癱大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)簡稱腦癱,是目前小兒最主要的運(yùn)動(dòng)功能傷殘性疾病。目前對(duì)于CP的治療僅限于對(duì)癥支持,缺乏特效治療,故CP仍為當(dāng)今小兒健康發(fā)育研究領(lǐng)域的重要課題之一。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新、高增殖能力和多種分化潛能,近年來,NSCs被發(fā)現(xiàn)具有低免疫原性、能整合于宿主細(xì)胞及長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)而成為轉(zhuǎn)基因治療的理想載體細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vaseula

2、r endothelial growthfactor,VEGF)能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,加速新生血管的形成,此外,VEGF還直接作用于神經(jīng)細(xì)胞,具有神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)發(fā)生作用。已有研究表明,將轉(zhuǎn)染VEGF基因的NSCs移植治療暫時(shí)性成年鼠腦缺血,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染VEGF基因的NSCs可在宿主腦組織中移行和表達(dá)基因產(chǎn)物,并對(duì)宿主局部血管和神經(jīng)結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。迄今為止,尚未見VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植治療新生CP大鼠的報(bào)道。
　　 目的:

3、本實(shí)驗(yàn)擬探討VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植對(duì)新生腦癱大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 方法:本研究室既往已經(jīng)構(gòu)建攜帶VEGF165基因的重組慢病毒載體pOC-FU-VEGF165,并感染體外分離培養(yǎng)的NSCs。本實(shí)驗(yàn)首先使用Rice法制作新生CP大鼠動(dòng)物模型,并通過神經(jīng)行為學(xué)及腦組織病理形態(tài)學(xué)對(duì)模型進(jìn)行鑒定。將7日齡SD大鼠隨機(jī)分成5組,假手術(shù)組(CON組)、腦癱模型組(CP組),腦癱模型聯(lián)合緩沖液移植組(PBS組)、腦癱模型聯(lián)合VEGF轉(zhuǎn)

4、染NSCs移植治療組(VEGF+NSCs組)、腦癱模型聯(lián)合NSCs移植治療組(NSCs組)。PBS組、VEGF+NSCs組、NSCs組在CP模型后3d于大鼠左側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)分別立體定位注射2μL緩沖液、轉(zhuǎn)染NSCs的攜帶VEGF基因的重組慢病毒載體(病毒感染復(fù)數(shù)moi值為50TU/個(gè)細(xì)胞,NSCs細(xì)胞個(gè)數(shù)5*104/ul)、NSCs懸液(NSCs細(xì)胞個(gè)數(shù)5*104/ul)。14日齡時(shí)觀察大鼠體重增長情況,采用VEGF免疫組織化學(xué)法檢測(cè)

5、鼠腦組織VEGF蛋白表達(dá);3～4周齡時(shí)采用放射形迷宮覓水試驗(yàn)、握持試驗(yàn)及足錯(cuò)誤試驗(yàn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試;35日齡采用HE染色法觀察鼠腦組織病理學(xué)。
　　 結(jié)果:第一部分應(yīng)用單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎結(jié)合缺氧的方法制作新生CP大鼠,CP組動(dòng)物握持時(shí)間較對(duì)照組縮短,足錯(cuò)誤次數(shù)較對(duì)照組增加,HE染色提示CP組存在不同程度的腦損傷,證實(shí)CP模型動(dòng)物存在神經(jīng)行為學(xué)及腦組織病理學(xué)的改變;第二部分1.體重增長率測(cè)定:VEGF+NSCs組、NSCs組體重增

6、長率明顯高于CP組和PBS組(P＜0.05);2.鼠腦組織VEGF免疫組化檢測(cè):VEGF+NSCs組、NSCs組的VEGF免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)較CP組和PBS組明顯增加(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組VEGF陽性細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05);3.放射形迷宮覓水試驗(yàn):①覓水時(shí)間比較:VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水時(shí)間較CP組和PBS組明顯縮短(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組覓水時(shí)間縮短(P＜0.05

7、):②覓水錯(cuò)誤次數(shù):VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水錯(cuò)誤次數(shù)較CP組及PBS組明顯減少(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組錯(cuò)誤次數(shù)減少(P＜0.05);③覓水重復(fù)次數(shù):VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水重復(fù)次數(shù)較CP組及PBS組明顯減少(P＜0.05),VEGF+NSCs組與CON組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);4.握持試驗(yàn)結(jié)果:VEGF+NSCs組、NSCs組的握持時(shí)間較CP組和PBS組明顯延長(P＜0

8、.05);5.足錯(cuò)誤試驗(yàn):VEGF+NSCs組、NSCs組的錯(cuò)誤次數(shù)較CP組和PBS組明顯減少(P＜0.05);6.腦組織HE染色顯示:CP組和PBS組鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂,神經(jīng)細(xì)胞減少、變性壞死,膠質(zhì)細(xì)胞增生;VEGF+NSCs組、NSCs組細(xì)胞變性壞死減輕,偶見核固縮。
　　 結(jié)論:使用VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植治療新生腦癱大鼠,可增加新生鼠腦組織VEGF蛋白的表達(dá),減輕缺氧缺血性腦損傷,改善遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能,具有神經(jīng)保護(hù)作用