APRIL阻斷劑BCMA-Fc的表達(dá)、純化及活性研究.pdf

1、TNF超家族在細(xì)胞增殖、分化和死亡中起著十分重要的作用。其主要成員TNFa，TNFb(LTa)，LTb，TRAIL，F(xiàn)AS配體等，在免疫調(diào)節(jié)及免疫應(yīng)答中的作用已被廣泛認(rèn)識(shí)。增殖誘導(dǎo)配體APRIL和B淋巴細(xì)胞刺激因子BAFF(又名:Blys)是TNF配體超家族新近發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)關(guān)系密切的成員。通過(guò)與其受體BAFF-R，BCMA，TACI相互作用，在B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和發(fā)育，抗體類型轉(zhuǎn)換、生發(fā)中心維持以及T細(xì)胞共刺激等方面發(fā)揮著重要的作用。<

2、br>　　BAFF/APRIL系統(tǒng)(BAFF, APRIL和它們的受體)在自身免疫性疾病和B淋巴細(xì)胞系惡性腫瘤的發(fā)生和維持過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化以及一些惡性腫瘤中，BAFF和APRIL的表達(dá)水平升高。BAFF/APRIL系統(tǒng)成為研究自身免疫性疾病藥物的新的靶點(diǎn)。利用抗體或欺騙性受體阻斷過(guò)多BAFF/APRIL成為治療自身免疫性疾病的有效方法。
　　分子模擬技術(shù)為蛋白質(zhì)的研究提

3、供了一種嶄新的手段，在理論上解決了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能分析以及蛋白質(zhì)工程實(shí)施方面所面臨的難題。它在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和模建工作中占有舉足輕重的地位，實(shí)現(xiàn)了生物技術(shù)與計(jì)算機(jī)技術(shù)的完美結(jié)合。通過(guò)分子模擬技術(shù)設(shè)計(jì)欺騙性受體BCMA-Fc融合蛋白三維結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)分子對(duì)接預(yù)測(cè)BCMA-Fc具備結(jié)合APRIL的能力。
　　由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有易操作，生長(zhǎng)速度快，營(yíng)養(yǎng)要求低以及表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此選擇畢赤酵母菌種GS115作為目的基因BCMA-F

4、c的宿主表達(dá)菌，選擇pPIC9K質(zhì)粒作為表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)商業(yè)化質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化畢赤酵母表達(dá)的目的蛋白N末端不均一。這是由于α-factor信號(hào)肽序列加工過(guò)程中兩種信號(hào)肽酶Kex2和Stel13作用位點(diǎn)不同造成的。在此基礎(chǔ)上重新改造商業(yè)化質(zhì)粒pPIC9K使其表達(dá)的目的蛋白的具有原始的，均一的N末端。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為真核生物表達(dá)系統(tǒng)具有對(duì)表達(dá)的蛋白翻譯后加工和修飾的優(yōu)點(diǎn)，其中包括對(duì)表達(dá)外源蛋白過(guò)進(jìn)行糖基化修飾，形成糖蛋白。但是由

5、于修飾后蛋白質(zhì)的糖鏈長(zhǎng)度不同造成外源蛋白的分子量大小不同。根據(jù)畢赤酵母蛋白質(zhì)糖基化修飾位點(diǎn)的特點(diǎn)，通過(guò)目的基因序列與目的蛋白氨基酸序列比對(duì)分析后，對(duì)目的蛋白糖基化位點(diǎn)基因序列進(jìn)行點(diǎn)突變形成具有均一分子量的目的蛋白。酵母菌對(duì)外源基因的表達(dá)與外源基因密碼子的選用有關(guān)。了解表達(dá)系統(tǒng)宿主在密碼子使用上的偏愛(ài)性對(duì)目的蛋白的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后基因序列在畢赤酵母中目的蛋白的表達(dá)量的顯著提高。為了進(jìn)一步的研究BCMA-Fc的生物活性功能，需

6、要獲得大量的目的蛋白，對(duì)BCMA-Fc進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵研究和目的蛋白純化條件的優(yōu)化。發(fā)酵研究中主要針對(duì)培養(yǎng)基的組成，誘導(dǎo)方式以及誘導(dǎo)條件(溫度，pH)等進(jìn)行優(yōu)化，最終通過(guò)優(yōu)化后的發(fā)酵條件實(shí)現(xiàn)了目的蛋白在畢赤酵母中的高表達(dá)。由于BCMA-Fc融合蛋白中具有IgG1Fc片段，可以與ProteinA進(jìn)行結(jié)合利于純化，提高了純化的效率。細(xì)胞外活性實(shí)驗(yàn)顯示目的蛋白BCMA-Fc具備配體APRIL結(jié)合能力，細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明BCMA-Fc可以阻斷AP

7、RIL對(duì)Raji B淋巴細(xì)胞瘤的增殖。實(shí)驗(yàn)證明畢赤酵母表達(dá)的BCMA-Fc具有完整的生物學(xué)活性。
　　為了比較不同表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白BCMA-Fc的影響，選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)目的基因的主要優(yōu)勢(shì):一個(gè)是宿主的遺傳背景比較清楚，易于控制基因的表達(dá);另一個(gè)是大腸桿菌容易培養(yǎng)，可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。另外，一些改造的大腸桿菌宿主細(xì)胞中含有硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶基因利于形成正確折疊的含有二硫鍵的

8、蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。選擇pET28a和pET23d質(zhì)粒作為BCMA-Fc基因的表達(dá)載體，并對(duì)pET28a質(zhì)粒進(jìn)行改造使其作為表達(dá)載體進(jìn)行目的基因表達(dá)時(shí)增加目的蛋白的可溶性。但是為了適應(yīng)宿主細(xì)胞的要求，選擇pET23d作為目的基因的表達(dá)載體。構(gòu)建pET23d-BCMA-Fc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)現(xiàn)了BCMA-Fc的可溶性表達(dá)。通過(guò)rProteinA親和層析，分子篩，Q柱進(jìn)行純化。細(xì)胞外活性檢測(cè)顯示目的蛋白BCMA-

9、Fc具備配體APRIL結(jié)合能力，細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)說(shuō)明BCMA-Fc阻斷APRIL對(duì)Raji B淋巴細(xì)胞瘤的增殖的作用并且和畢赤酵母表達(dá)的目的蛋白BCMA-Fc的細(xì)胞活性沒(méi)有差別。
　　搖瓶表達(dá)研究的基礎(chǔ)上我們對(duì)目的蛋白進(jìn)行BCMA-Fc大腸桿菌發(fā)酵研究，通過(guò)20L發(fā)酵罐進(jìn)行LB培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)以及純化研究。為了進(jìn)一步研究目的蛋白的活性，我們建立MOG抗原誘導(dǎo)的自身免疫性腦脊髓炎模型檢測(cè)蛋白活性。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是研究多發(fā)

10、性硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型，是由同種型、異種型神經(jīng)組織抗原誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)免疫炎性脫髓鞘性模型。其病理特征和MS相似，均表現(xiàn)為CNS白質(zhì)脫髓鞘改變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)發(fā)病的動(dòng)物模型進(jìn)行病理學(xué)切片分析，HE染色光鏡下可見(jiàn)EAE組小鼠腦組織和脊髓組織中有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。初步建立了EAE動(dòng)物模型，并為目的蛋白生物體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　我們分別利用畢赤酵母和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了達(dá)目的蛋白BCMA-Fc的高效表達(dá)，進(jìn)行活性