人胚胎著床過程中細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化及米非司酮對其的影響.pdf

1、第一部分子宮內(nèi)膜蛻膜化過程中細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化 [研究目的] 研究子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程中多個細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化以探討對胚胎著床的影響。 [材料和方法] 1.取著床窗口期子宮內(nèi)膜，0.25％膠原酶消化，過濾、貼壁提純子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(endometrialstromalcells，ESC)。采用波形蛋白抗體Vimentin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞純度。計數(shù)1×106個ESC，1ml無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收

2、集上清液。 2.收集早孕蛻膜組織，0.25％胰酶—EDTA消化，Percoll梯度提純蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(decidualizedstromalcells，DSC)。并觀察其在體外培養(yǎng)的生長特征。泌乳素(PRL)抗體免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞純度。計數(shù)1×106個DSC，1ml無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集上清液。 3.利用Luminex檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中15種細(xì)胞因子：TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL

3、-6、IL-8、IL-10、IL-12、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、MCP-1、RANTES的濃度。比較這些細(xì)胞因子在著床窗口期子宮內(nèi)膜與早孕期蛻膜細(xì)胞的變化。利用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，獨立樣本t檢驗比較DSC組和ESC組之間因子表達(dá)量的差異，用Spearman相關(guān)分析因子表達(dá)量之間的相關(guān)性。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 [結(jié)果] 1.SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)證實DSC的PRL抗體表達(dá)為陽性，細(xì)

4、胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒；ESC的波形蛋白抗體表達(dá)為陽性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒；實驗所用的ESC和DSC純度均在95％以上，且生物學(xué)特性得以維持。 2.子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌的上清液中，占優(yōu)勢的細(xì)胞因子的含量由高到低依次是IL-8、IL-6、IP-10、MCP-1、MIP-1α、TNF-α、GM-CSF、G-CSF。在DSC分泌的上清液中，占優(yōu)勢的細(xì)胞因子的含量由高到低依次是IL-8、MCP-1、IL-6、IP-10、GM-

5、CSF、G-CSF、MIP-1α。上述因子可能在胚胎著床過程中發(fā)揮重要作用。 3.蛻膜化后的DSC分泌細(xì)胞因子的表達(dá)譜與著床窗期的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌的因子表達(dá)譜相比，有明顯的變化，其中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES含量減低，統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異；DSC分泌IL-4的含量與ESC相比升高，也有顯著性差異；MCP-1、IL-2、I

6、L-12的表達(dá)在兩者之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。 4.蛻膜化過程中，IL-1β與TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES之間存在明顯正相關(guān)；IL-2與IL-12存在明顯正相關(guān)；TNF-α與MCP-1存在明顯正相關(guān)；TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES、IP-10彼此之間兩兩成正相關(guān)。 [

7、結(jié)論] 1.子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程中多種細(xì)胞因子對于DSC的誘導(dǎo)和維持很重要，不同的因子作用各異，并且通過調(diào)控蛻膜化而影響胚胎著床。Th1型細(xì)胞細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)、趨化因子(IL-8、MCP-1、MIP-1α、RANTES、IP-10)、IL-1β、GM-CSF和G-CSF表達(dá)減低，表明母體面的免疫功能受到抑制，從而降低免疫排斥，有利于胚胎著床。Th2型細(xì)胞因子(IL-4)升高，起保護(hù)妊娠的的作用。 2.Lu

8、minex液相蛋白芯片分析系統(tǒng)具有靈活性好、通量大、靈敏度高、信噪比好的特點，能同時檢測到同一樣本多個極微量的分子蛋白，比其它的檢測方法具有更多優(yōu)勢。 第二部分人早孕絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立 [研究目的] 建立可保持絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的共培養(yǎng)細(xì)胞模型，應(yīng)用于研究滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲行為。 [材料和方法] 1.按孕周收集人早孕絨毛組織，0.125％胰酶、DNA酶

9、消化，過濾，BSA梯度沉降提純絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillouscytotrophoblasts，EVCT)。細(xì)胞角蛋白CK7免疫細(xì)胞化學(xué)法、TGF-β2免疫熒光染色法檢測EVCT的純度。 2.蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定同第一部分。 3.計數(shù)6×105個DSC放入微孔直徑為8μmTranswell的下室，計數(shù)1×105個EVCT放入5g/LMatrigel包被的Transwell上室孵育6h進(jìn)行體外侵襲實驗，觀

10、察EVCT的形態(tài)特征和在該共培養(yǎng)模型下滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲特性。 [結(jié)果] 1.SABC法免疫細(xì)胞化學(xué)證實EVCT的CK7抗體表達(dá)為陽性，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒；DSC的PRL抗體表達(dá)為陽性，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量棕黃色顆粒。實驗所用的EVCT和DSC純度均在95％以上。 2.細(xì)胞免疫熒光顯示95％以上的EVCT表達(dá)TGFβ2，在其細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中可觀察到陽性表達(dá)的綠色熒光。Transwell上室中的EVCT保持

11、了其侵襲能力，EVCT在Matrigel包被的濾膜中的侵襲指數(shù)為3.22±0.04。 [結(jié)論] 適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)方法可獲得高純度的EVCT細(xì)胞和DSC細(xì)胞，并使其維持特有的生物學(xué)活性，成功地建立了共培養(yǎng)系統(tǒng)模型，便于研究EVCT侵襲和胚胎著床的機制。 第三部分滋養(yǎng)細(xì)胞侵入時的細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化 [研究目的] 探討早孕期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵入到蛻膜細(xì)胞時母胎界面細(xì)胞因子表達(dá)譜的變化。 [材料和方法]

12、 1.EVCT細(xì)胞和EVCT/DSC共培養(yǎng)系統(tǒng)體外培養(yǎng)方式同前。 2.計數(shù)2×105個EVCT放入微孔直徑為0.4μmTranswell的上室，計數(shù)6×105個DSC放入Transwell的下室，加入0.8ml無血清培養(yǎng)液在Transwell小室中培養(yǎng)48h后收集上清液。同樣數(shù)目同批次的EVCT和DSC混合接種在24孔培養(yǎng)板，加入0.8ml無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集上清液。計數(shù)1×106個EVCT單獨種植在24孔培養(yǎng)板

13、中，1ml無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后收集上清液。Luminex檢測各組培養(yǎng)上清液中15種因子(同前)的濃度。滋養(yǎng)細(xì)胞/蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)組與單獨蛻膜細(xì)胞組和單獨滋養(yǎng)細(xì)胞組多重比較揭示了蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞間的相互影響。滋養(yǎng)細(xì)胞/蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)組之間按照在早孕時不同階段(≤9周，＞9周)和共培養(yǎng)方式不同(Transwell和混合培養(yǎng))互相比較反映了細(xì)胞因子表達(dá)的變化。Oneway—ANOVA、獨立樣本t檢驗和Spearman相關(guān)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

14、 3.人早孕期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞/蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子與單純蛻膜細(xì)胞分泌的因子相比，許多因子發(fā)生了變化：其中[結(jié)論] 多種細(xì)胞因子在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲中起重要作用。在著床過程中IL-1β、MCP-1、RANTES、IL-6上調(diào)可以增強滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，G-CSF、GM-CSF、IL-8、IP-10、MIP-1α顯著下降抑制了NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。和蛻膜共培養(yǎng)可以降低IFN-γ、IL-2、IL-12

15、、IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、G-CSF、MIP-1α、MCP-1、RANTES的含量，減輕母體對胚胎的排斥，是妊娠成功的關(guān)鍵。 第四部分米非司酮對著床過程中細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響 [研究目的] 研究孕激素拮抗劑米非司酮(RU486)對早孕期滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響以探討其終止早孕的分子機制。 [材料和方法] 1.EVCT細(xì)胞和EVCT/DSC共培養(yǎng)系統(tǒng)體外培養(yǎng)方式同前

16、。 2.同批來源的滋養(yǎng)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞/蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分為2組，一組加入含1×10-6mol/L的RU486的無血清培養(yǎng)液處理48h，一組為不含RU486的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h作為對照組，收集上清液。Luminex檢測兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中15種因子(同前)的濃度。配對t檢驗比較各組之間因子表達(dá)量的差異，探討RU486對母胎界面的細(xì)胞因子的影響。 [結(jié)果] 1.用米非司酮處理后，滋養(yǎng)細(xì)胞/蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)細(xì)胞

17、因子表達(dá)降低的有：IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES、MCP-1；表達(dá)升高的有：TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、IFN-γ；無影響的有：IL-2、IP-10。 2.米非司酮處理單獨培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子發(fā)生變化：其中IL-2、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α表達(dá)下降；TNF-α、IL-1β、IFN-γ升高；IL-4、IL-6、IL-8、IL-