肝癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移兩重要分子MDK和GOLPH2的臨床意義及功能分析.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（簡(jiǎn)稱肝癌）是世界上最常見(jiàn)、惡性度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位、死因第3位，是我國(guó)惡性腫瘤第2位死因。盡管近幾十年來(lái)對(duì)肝癌的基礎(chǔ)研究和診斷治療都取得了顯著進(jìn)步，但肝癌患者的總體預(yù)后仍差，5年生存率不足5％。導(dǎo)致目前肝癌病人總體預(yù)后差的主要原因有兩個(gè)方面。一是多數(shù)患者未能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期有效治療。近年隨著肝癌診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步，部分患者通過(guò)早期診斷及早期根治切除獲得了較好的療效，5年生存率達(dá)50％-60

2、％。但是目前只有10％-20％肝癌病人在診斷時(shí)具有根治性治療的機(jī)會(huì)。盡管甲胎蛋白(AFP)在肝癌的臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用，但其對(duì)早期/小肝癌和AFP陰性肝癌的診斷仍存在明顯不足，迫切需要新的陽(yáng)性率和敏感性更高的肝癌診斷指標(biāo)，以進(jìn)一步提高肝癌的早期診斷率。
　　肝癌患者預(yù)后差的另外一個(gè)重要原因是肝癌術(shù)后的高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌患者術(shù)后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高達(dá)60％-70％，即使小肝癌亦達(dá)40％，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的

3、另一個(gè)主要障礙。如能探明肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理及其關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，將有助于探索有效的干預(yù)措施和治療手段，以進(jìn)一步提高肝癌治療效果、延長(zhǎng)病人生存。
　　本所前期采用基因芯片技術(shù)比較伴與不伴轉(zhuǎn)移肝癌之間、肝癌轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)瘤之間基因表達(dá)譜的差異，在國(guó)際上首次提出促使肝癌轉(zhuǎn)移的基因改變始于原發(fā)腫瘤階段的新觀點(diǎn)(Ye QH，et al.Nat Med2003)，為肝癌轉(zhuǎn)移早期預(yù)測(cè)和分子干預(yù)奠定了理論基礎(chǔ)。最近，我們進(jìn)一步將激光捕獲顯微切割(LCM

4、)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合，研究伴和不伴肝外轉(zhuǎn)移肝癌原發(fā)瘤之間基因表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)了以高爾基體Ⅱ型膜蛋白GOLPH2(typeⅡ Golgi membrane protein)為首的一組可能在肝癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起重要作用的候選基因，可能成為肝癌轉(zhuǎn)移的重要干預(yù)靶點(diǎn)。同時(shí)，我們還通過(guò)生物信息學(xué)分析方法在全基因組范圍內(nèi)篩選出5個(gè)在肝癌組織中高表達(dá)的基因:MDK、PEG10、GPC3、SERPINI1和QP-C，其聯(lián)合組織檢測(cè)對(duì)肝癌診斷的敏感性達(dá)84

5、％（包括AFP陰性肝癌和小肝癌）。其中MDK為分泌性蛋白，可在血清中檢測(cè)，有望成為新的肝癌早期診斷血清學(xué)標(biāo)記物(JaHL, et al.Clin Cancer Res2007)。
　　基于此，本課題首先通過(guò)大樣本、多中心檢測(cè)血清MDK在肝癌、特別是AFP陰性肝癌和小肝癌中的表達(dá)，分析其在肝癌早期診斷中的價(jià)值及其臨床意義。同時(shí)，對(duì)高爾基體膜蛋白GOLPH2在肝癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的重要作用及其關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)研究，探討其作為肝癌轉(zhuǎn)移分子

6、干預(yù)靶點(diǎn)的可行性。
　　第一部分血清MDK對(duì)甲胎蛋白陰性肝癌和早期肝癌的診斷價(jià)值
　　目的:本研究通過(guò)檢測(cè)血清MDK評(píng)估其對(duì)肝癌特別是AFP陰性肝癌和早期肝癌的臨床診斷價(jià)值。
　　方法:通過(guò)組織芯片免疫組化染色檢測(cè)105例包含有肝癌及癌旁和肝硬化組織中MDK蛋白水平的表達(dá)情況。進(jìn)一步通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linkedimmunosorbent assays ELISAs)定量檢測(cè)總共501例來(lái)自兩個(gè)臨床醫(yī)

7、學(xué)中心包含445位不同受試人群的血清樣本（包括肝癌、乙肝肝硬化、肝良性占位、消化道惡性腫瘤和正常人群），結(jié)合受試者血清AFP、腫瘤大小和巴塞羅那分期(BCLC)，分析血清MDK診斷肝癌特別是AFP陰性肝癌和早期肝癌的敏感性和特異性。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示，癌組織中MDK表達(dá)水平顯著高于癌旁及肝硬化無(wú)瘤組織(P＜0.0001)。與對(duì)照組(n=193)相比，測(cè)試組HCC(n=84)人群的血清MDK水平(1.346 ng/ml;0

8、.864-1.802)明顯升高(P=0.0001);且血清MDK和AFP的受試者工作曲線下面積(AUROC)分別為:0.87和0.69，前者顯著高于后者(P＜0.000)。在另外一套由163例肝細(xì)胞癌患者構(gòu)成的獨(dú)立大樣本驗(yàn)證隊(duì)列中(cohort C)，以0.752ng/ml作為MDK的診斷閾值，其診斷HCC的敏感性顯著高于血清AFP(20ng/ml)(83.3％ vs51.2％)，而特異性與AFP相近(81.1％ vs76.7％);即便

9、是在AFP陰性(＜20 ng/ml)肝癌患者中，其敏感性仍可高達(dá)82.9％。另外，在診斷早期(BCLC O/A)肝癌患者方面，血清MDK的敏感性(82.3％)亦顯著高于AFP(45.2％)。甚至在20例極早期(BCLC O)肝癌患者中，血清MDK的診斷敏感性為AFP的兩倍(76.2％ vs38.1％)，而且兩者聯(lián)合檢測(cè)能進(jìn)一步提高極早期肝癌患者的檢出率到90％。通過(guò)研究患者手術(shù)前后及復(fù)發(fā)前后配對(duì)血清MDK水平的變化，發(fā)現(xiàn)患者手術(shù)后血清M

10、DK明顯下降(從術(shù)前的1.362±0.362ng/ml降至術(shù)后的0.482±0.281ng/ml; P＜0.001)，而且隨訪發(fā)現(xiàn)，MDK的水平隨著患者術(shù)后的復(fù)發(fā)重新升高。
　　結(jié)論:血清MDK在肝癌、包括AFP陰性肝癌和早期/極早期肝癌患者中顯著升高，可能成為超越AFP的肝癌早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)新指標(biāo)。
　　第二部分高爾基體Ⅱ型膜蛋白(GOLPH2)空間調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)內(nèi)吞/循環(huán)促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移
　　目的:

11、對(duì)前期通過(guò)激光捕獲顯微切割和基因表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn)的與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的候選基因GOLPH2進(jìn)行重點(diǎn)研究，明確其在肝癌轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的重要作用及其關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)，探討其作為肝癌轉(zhuǎn)移分子干預(yù)靶點(diǎn)的可行性。
　　方法:運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝癌及其癌旁組織、正常肝組織、高低轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞系中GOLPH2的mRNA表達(dá)水平，比較分析其表達(dá)水平與肝癌轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)組織芯片免疫組化染色檢測(cè)另外一套獨(dú)立肝癌樣本中GOLPH2表

12、達(dá)及其與肝癌患者預(yù)后的相關(guān)性。通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾/過(guò)表達(dá)技術(shù)及體內(nèi)外細(xì)胞功能試驗(yàn)，驗(yàn)證GOLPH2在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)程中的重要作用。為了進(jìn)一步研究GOLPH2促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，我們還運(yùn)用IP-PULL DOWN串聯(lián)質(zhì)譜分析尋找與GOLPH2可能相互作用的蛋白，并進(jìn)一步利用免疫共沉淀和激光共聚焦共定位驗(yàn)證相互作用的靶蛋白。最后采用生物素標(biāo)記的細(xì)胞膜分離純化技術(shù)、活細(xì)胞分子動(dòng)態(tài)顯像技術(shù)和Western-blot等技術(shù)探討GOLP

13、H2調(diào)節(jié)EGFR內(nèi)吞循環(huán)促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示，與癌旁組織和正常肝組織相比，肝癌組織中GOLPH2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.0001），伴轉(zhuǎn)移肝癌組織中GOLPH2表達(dá)較無(wú)轉(zhuǎn)移肝癌顯著增高(P＜0.05)，特別在肝癌肝外轉(zhuǎn)移人群中表達(dá)更高（P＜0.01）。在高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系中GOLPH2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，GOLPH2主要表達(dá)于腫瘤組

14、織中，其表達(dá)水平的高低與患者的預(yù)后相關(guān)。GOLPH2低表達(dá)患者的至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)及總體生存(OS)顯著高于GOLPH2高表達(dá)患者（TTR:P=0.019;OS:P=0.007）。多因素分析結(jié)果也提示GOLPH2是一個(gè)影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素（P=-0.023）。細(xì)胞體內(nèi)和體外基因Gainand loss研究證實(shí)GOLPH2是一個(gè)促進(jìn)肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的原癌基因。通過(guò)篩選GOLPH2相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)GOLPH2作為一種主要定位于反式高爾基體