丹酚酸B聯(lián)合TNF-alpha拮抗劑促進大鼠急性脊髓損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，通常導(dǎo)致嚴重的殘疾，其病理生理過程包括連續(xù)發(fā)生的原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)損傷造成了損傷局部組織連續(xù)性的破壞，而繼發(fā)損傷則激活了多個化學(xué)通路如缺血、缺氧、自由基產(chǎn)生、凋亡／變性受體上調(diào)及炎癥級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生比原發(fā)損傷更嚴重的影響。大量實驗證實脊髓繼發(fā)性損傷是引起脊髓進行性功能喪失的主要原因。針對繼發(fā)性脊髓損傷的研究是對受損脊髓的保護和治療的研究重點之一。因

2、此研究能減輕脊髓損傷引起的炎癥反應(yīng)和繼發(fā)損傷，并且具有神經(jīng)保護作用的藥物具有很大的應(yīng)用前景和優(yōu)勢。 丹參(salvia miltiorrhiza，Danshen)是我國傳統(tǒng)中藥一味上品。其主要有效成分是水溶性成分，含量最高的是丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)。已有研究證明Sal B具有很強的抗氧化作用和明顯的抗炎作用。還有研究表明，復(fù)方丹參注射液能減輕脊髓損傷繼發(fā)損傷，促進脊髓修復(fù)。然而，臨床應(yīng)用的丹

3、參注射液中丹酚酸B的含量不高，再加上制藥工藝限制，丹酚酸B極易損失或受到破壞，藥物的有效成分及治療效果往往不能得到保證。另外丹酚酸B不僅效價較高，其注射液和丹參注射液相比，也較少引起過敏反應(yīng)。本室畢小彬首次將丹酸酸B單體應(yīng)用于脊髓損傷的治療研究中，將Sal B與骨髓間質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)移植聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)Sal B能促進移植到損傷部位的MSCs存活，并可發(fā)揮促進損傷大鼠功能恢復(fù)的協(xié)同作用。而高

4、純度的Sal B單獨應(yīng)用能否對急性脊髓損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，它的作用是否與應(yīng)用劑量相關(guān)呢? 炎癥反應(yīng)是脊髓繼發(fā)損傷的一個重要部分，在繼發(fā)損傷發(fā)生、發(fā)展及演變過程中舉足輕重。介導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的是一類重要的細胞因子，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是一個重要的代表。在脊髓損傷的特定環(huán)境下TNF-a早期大量表達并參與了脊髓炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其作用受體分布廣泛。除了誘導(dǎo)炎性反應(yīng)外TNF-a還能

5、影響生化代謝、組織攝氧能力及組織內(nèi)壓力。本室畢小彬發(fā)現(xiàn)，TNF-a對MSCs的體外殺傷作用可被Sal B拮抗，提示Sal B減輕炎癥反應(yīng)的機制可能與對抗TNF-a有關(guān)。那么，Sal B在體內(nèi)產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用是否與干預(yù)了TNF-alpha的過表達有關(guān)呢? 依那西普(etanercept，ETA)為重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白，是一種水溶性TNF-a拮抗劑，可競爭性與受體結(jié)合，從而阻斷TNF-alpha的活性作用。有實

6、驗證實，ETA可減輕急性脊髓損傷的炎癥反應(yīng)，降低組織損傷，并改善預(yù)后。這些發(fā)現(xiàn)使其也成為干預(yù)急性脊髓損傷的備選用藥之一。 脊髓損傷有三個臨床分期：損傷72h內(nèi)為急性損傷期，72h至14d為亞急性期，14d至12個月之后為慢性期。脊髓損傷治療的時間窗選擇非常關(guān)鍵，大量研究表明，如不在急性期及時干預(yù)，則治療效果更不理想。炎癥反應(yīng)是機體的自我保護、自我修復(fù)的手段，但損傷早期炎癥反應(yīng)的過度激活對機體而言弊大于利。炎癥反應(yīng)是一個可逆的病理

7、生理過程，因此，在急性期給予有效的藥物干預(yù)，減輕炎癥反應(yīng)，減少繼發(fā)損傷，從而改善預(yù)后，是現(xiàn)階段脊髓損傷治療研究的一個重要方向。 綜上所述，本實驗擬在本室的前期基礎(chǔ)上，探討傳統(tǒng)中藥單體丹酚酸B在急性脊髓損傷的應(yīng)用價值，觀察Sal B能否對急性脊髓損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，能否減輕脊髓繼發(fā)損傷，減輕ASCI后的組織損傷和水腫，能否促進損傷后的功能恢復(fù)，是否存在劑量相關(guān)性；并進一步觀察Sal B是否能減少重要炎癥因子TNF-a表達和分泌，

8、探討Sal B抗ASCI繼發(fā)損傷炎癥反應(yīng)的相關(guān)機理，尋找Sal B抗ASCI繼發(fā)損傷炎癥反應(yīng)的作用靶點，為臨床用藥提供依據(jù)，同時將Sal B與TNF-a拮抗劑依那西普協(xié)同應(yīng)用，觀察能甭結(jié)合兩個藥物的優(yōu)勢，更進一步地減輕SCI后的炎性細胞浸潤，減少ASCI時過表達的TNF-a。 本實驗的研究內(nèi)容由以下兩部分組成： 第1部分：丹酚酸B促進大鼠急性脊髓損傷修復(fù)及量效關(guān)系探討 目的：設(shè)定2mg／kg，10mg／kg，20

9、kg／kg三個丹酚酸B劑量組，腹腔注射到對脊髓損傷體內(nèi)，觀察損傷后組織損傷情況和損傷局部水腫程度，以及對大鼠功能恢復(fù)的影響，探討丹酚酸B在脊髓損傷治療的應(yīng)用價值，并得到初步的量效關(guān)系。 方法：48只大鼠隨機分為4組：Sal B高劑量組(20mg／kg組)，Sal B中劑量組(10mg／kg組)，Sal B低劑量組(2mg／kg組)，PBS對照組，每組12只。制作大鼠脊髓挫傷模型，治療組腹腔注射各劑量丹酚酸B，對照組注射PBS。損

10、傷后4小時取損傷節(jié)段，用比色法檢測髓過氧化物酶活性；損傷后1天取損傷脊髓節(jié)段，制成石蠟切片，進行HE染色，用免疫組織化學(xué)染色法檢測MMP-1、c-Fos抗體表達情況。損傷后3天取損傷節(jié)段，用干濕重法評價的水腫程度，并采用BBB評分評價10天內(nèi)大鼠的運動功能恢復(fù)情況。 結(jié)果： 1.損傷后4小時髓過氧化物酶活性檢測，Sal B治療組MPO活性下降，與PBS組相比，高劑量組(20mg／kg組)最顯著，統(tǒng)計學(xué)分析P<0.05。

11、 2.與PBS對照組相比，損傷后1天HE染色切片顯示Sal B組治療后局部組織損傷減輕，炎性細胞浸潤數(shù)量減少。 3.損傷后1天組織切片免疫組化染色結(jié)果顯示，Sal B治療組比PBS對照組MMP-1表達減少，c-Fos表達下調(diào)，高劑量組(20mg／kg組)與PBS組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 4.損傷后3天干濕重法評價水腫程度，Sal B治療組水腫程度輕于PBS組，統(tǒng)計學(xué)分析得高劑量組(20mg／kg組)與P

12、BS組相比，P<0.05。 5.從脊髓損傷后第7天起，Sal B組高劑量組(20mg／kg組)和PBS對照組之間的BBB評分有顯著性差異(P<0.05)。 6.Sal B減輕脊髓損傷的作用與濃度呈正相關(guān)，濃度越高，效應(yīng)越明顯。 結(jié)論：Sal B可減少脊髓損傷后的組織損傷，下調(diào)損傷相關(guān)因子MMP-1和即早刻表達核因子的表達，降低損傷局部髓過氧化物酶活性，減輕組織水腫，并能促進損傷大鼠的功能恢復(fù)。同時，Sal B減輕

13、脊髓繼發(fā)損傷的作用具有劑量相關(guān)性，劑量越高，作用更顯著。 第2部分：丹酚酸B鹽聯(lián)合TNF-a拮抗劑減輕大鼠脊髓繼發(fā)損傷 目的：觀察Sal B是否通過干預(yù)TNF-α表達，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用，探討聯(lián)合應(yīng)用Sal B和依那兩普治療大鼠脊髓損傷的可行性。 方法：75只大鼠在脊髓挫傷造模后，隨機分為5組：Sal B(20mg／kg)組，依那西普(5mg／kg)組，Sal B+依那西普組，PBS對照組，假手術(shù)組，每組15只

14、。損傷后4小時取損傷節(jié)段，用比色法檢測髓過氧化物酶活性；損傷后1天取損傷脊髓節(jié)段，用RT-PCR檢測TNF-a的mRNA表達，用Western blot檢測TNF-a蛋白表達，另一部分樣品制成石蠟切片，進行HE染色，損傷后3天取損傷節(jié)段，用干濕重法評價的水腫程度，并采用BBB評分評價10天內(nèi)大鼠的運動功能恢復(fù)情況。 結(jié)果： 1.RT-PCR結(jié)果灰度分析顯示，與PBS組相比，Sal B組TNF-a mRNA表達下降，統(tǒng)計學(xué)

15、分析有顯著性差異，P<0.05。 2.Western blot結(jié)果顯示，Sal B組TNF-a蛋白水平表達下調(diào)，與PBS組相比P<0.05。 3.Sal B與ETN聯(lián)用時能進一步減輕繼發(fā)損傷效應(yīng)： 1)與PBS對照組相比，損傷后1天HE染色切片顯示Sal B+ETN組治療后局部組織損傷明顯減輕，炎性細胞浸潤數(shù)量減少。 2)損傷后4小時髓過氧化物酶活性檢測，Sal B+ETN治療組MPO活性顯著下降，與PB

16、S組相比P<0.01，與Sal B或ETN單獨應(yīng)用時下降更明顯(P<0.05)。 3)RT-PCR和Western blot均顯示，Sal B+ETA治療組與Sal B或ETN單獨應(yīng)用組相比，TNF-alpha的下調(diào)作用更顯著(P<0.05)。 4)salB+ETN組損傷大鼠后肢功能恢復(fù)更好，從脊髓損傷后第3天起，和PBS對照組之間的BBB評分有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論：SalB能下調(diào)TNF-a在mRN

17、A水平和蛋白的表達，當(dāng)與ETN聯(lián)合應(yīng)用時可進一步減少脊髓損傷后的組織損傷，降低損傷局部髓過氧化物酶活性，減輕水腫，并能促進損傷大鼠的功能恢復(fù)。二者聯(lián)合應(yīng)用可達到更好的療效。 通過以上實驗研究，可得到以下結(jié)果： 1.Sal B能減輕脊髓損傷后的組織水腫程度，降低損傷局部髓過氧化物酶活性； 2.Sal B減輕脊髓損傷后的組織損傷和炎性細胞浸潤: 1)Sal B能下調(diào)代表細胞外基質(zhì)損傷的指標MMP-1表達；