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文檔簡(jiǎn)介
1、一、背景
天然產(chǎn)物來(lái)源廣泛,結(jié)構(gòu)多樣,藥理作用獨(dú)特,大多數(shù)都經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用,其療效確切,使用安全性高。目前有50%的臨床應(yīng)用藥物來(lái)自天然產(chǎn)物及其衍生物,并且許多結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物及其衍生物正處于臨床和臨床前研究階段。因此,從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒易得的先導(dǎo)化合物成為藥物研究的熱點(diǎn),天然產(chǎn)物在今后仍將是新藥的重要來(lái)源。
隨著各種分離、分析和結(jié)構(gòu)測(cè)定方法以及色譜、波譜聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展,化學(xué)分離和結(jié)構(gòu)鑒定已經(jīng)
2、不是天然藥物研究的瓶頸。目前天然產(chǎn)物研究面臨的一個(gè)問(wèn)題就在于其藥理活性和作用機(jī)制的闡述較少或研究不深,尤其是結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物。針對(duì)合理闡釋其作用機(jī)制和結(jié)合靶標(biāo)這一難點(diǎn),本文第一章綜述了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助的方法在天然產(chǎn)物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究中的應(yīng)用,希望能夠?yàn)榛钚蕴烊划a(chǎn)物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究的方法及相關(guān)技術(shù)提供一個(gè)比較全面的認(rèn)識(shí),然后進(jìn)一步將第一章的方法應(yīng)用到天然產(chǎn)物cynandione A和氯化兩面針堿(nitidine c
3、hloride,后文所用兩面針堿均指氯化兩面針堿)的機(jī)制研究中,來(lái)闡明這兩個(gè)天然產(chǎn)物如何發(fā)揮相應(yīng)的藥理活性。
腦卒中是一種死亡率高、致殘率高的常見(jiàn)病、多發(fā)病,并且近幾年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。缺血性腦卒中約占所有腦卒中(stroke)的80%,是指局部腦組織因血液循環(huán)障礙,缺血、缺氧而發(fā)生的軟化壞死。缺血性腦卒中的病因主要是由于供應(yīng)腦部血液的動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化和血栓形成,使管腔狹窄甚至閉塞,導(dǎo)致局灶性急性腦供血不足而發(fā)病;也有因
4、異常物體(固體、液體、氣體)沿血液循環(huán)進(jìn)入腦動(dòng)脈或供應(yīng)腦血液循環(huán)的頸部動(dòng)脈,造成血流阻斷或血流量驟減而產(chǎn)生相應(yīng)支配區(qū)域腦組織軟化壞死。目前臨床治療腦卒中的藥物由于其價(jià)格、抗藥性以及對(duì)出血、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)等毒副作用,應(yīng)用受到了一定的限制,因此,尋找高效低毒易得的分子來(lái)防治腦卒中尤為必要。
第二章介紹的天然產(chǎn)物cynandione A是從白首烏中分離得到的苯乙酮類(lèi)化合物,近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)cynandione A具有抗氧化、抗谷
5、氨酸興奮毒和胃保護(hù)等藥理活性。但目前對(duì)其作用機(jī)制尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,值得進(jìn)一步的深入研究。
多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis)至今仍是整個(gè)醫(yī)學(xué)界未解的難題之一。該病是一種慢性、自身免疫性疾病,通過(guò)破壞腦、脊髓以及視神經(jīng)的神經(jīng)纖維保護(hù)層髓磷脂,影響正常的神經(jīng)傳遞而導(dǎo)致身體殘疾。由于該病具有極高的復(fù)發(fā)率和致殘率,已成為常見(jiàn)的、重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。由于該病的發(fā)病高峰在30歲左右,因此,嚴(yán)重影響青壯年人口的工作和生
6、活質(zhì)量,也給國(guó)家和政府造成極大負(fù)擔(dān),制約社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展。
目前臨床上對(duì)該病尚無(wú)特效治療方法,缺乏令人滿(mǎn)意的治療藥物。急性期主要給予糖皮質(zhì)激素,復(fù)發(fā)-緩解期主要治療藥物包括:干擾素-γ,醋酸格拉替雷和單克隆抗體那他珠單抗。重度患者還可以考慮自體干細(xì)胞移植。西醫(yī)的激素療法雖然能夠緩解急性期癥狀,但毒副作用明顯,故不推薦長(zhǎng)期使用;免疫調(diào)節(jié)劑干擾素、格爾德霉素和那他珠單抗等不僅費(fèi)用昂貴,且長(zhǎng)期使用針對(duì)單一靶點(diǎn)藥物容易出現(xiàn)耐受。且上
7、述藥物均需經(jīng)靜脈、或注射給藥,不能有效改善多發(fā)性硬化癥復(fù)發(fā)和髓鞘脫失等問(wèn)題。因此,研制能夠有效控制多發(fā)性硬化癥的復(fù)發(fā)、改善髓鞘脫失的藥物具有重大意義。傳統(tǒng)中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn),因此,針對(duì)防治多發(fā)性硬化癥這一復(fù)雜性、難治性疾病具有一定優(yōu)勢(shì)。
第三章介紹的天然產(chǎn)物兩面針堿是從蕓香科植物兩面針[Zanthoxylum nitidum(Roxb.) DC]的根中分離到的具有多種藥理活性的苯駢菲啶類(lèi)生物堿,是兩面針的
8、主要有效成分,是兩面針及其制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分。近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)氯化兩面針堿在抗炎、鎮(zhèn)痛、抗真菌、抗瘧以及抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理活性、開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和應(yīng)用前景?;谏鲜鲅芯窟M(jìn)展,并且目前對(duì)兩面針堿的免疫調(diào)控作用尚未進(jìn)行充分報(bào)道,本章首先探討了兩面針堿潛在的治療多發(fā)性硬化癥的藥理活性,進(jìn)而在體外細(xì)胞模型上研究?jī)擅驷槈A對(duì)不同種類(lèi)和活化狀態(tài)的免疫細(xì)胞的調(diào)控作用,最后采用親和層析的方法尋找與兩面針堿存在相互作用的蛋白質(zhì)以解釋其作用靶標(biāo),更
9、深一層地闡明兩面針堿的作用機(jī)制。
2、目的
采用文獻(xiàn)綜述的方法進(jìn)一步研究活性天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿的作用機(jī)制,為合理開(kāi)發(fā)利用天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿提供重要的科學(xué)依據(jù),并為尋找及發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)控藥物提供化學(xué)小分子模板。
3、方法
(1)通過(guò)清除自由基、抗氧化和抗谷氨酸興奮毒的活性篩選,發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)物cynandione A,然后,采用
10、二維電泳和LC-MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究cynandione A神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(缺血性腦卒中)模型,探討cynandioneA神經(jīng)保護(hù)作用及其體內(nèi)抗缺血性腦卒中損傷的機(jī)制。SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internalcarotid artery,ICA)、頸外動(dòng)脈(e
11、xternal carotid artery,ECA)。結(jié)扎CCA近心端、ECA起始端后,在CCA處剪“V”形小口,沿CCA插入線(xiàn)栓(長(zhǎng)40mm,直徑0.26 mm,并于20 mm長(zhǎng)處標(biāo)記),經(jīng)ICA向顱內(nèi)插至大腦中動(dòng)脈分叉處,插入深度為18-20 mm。再灌注時(shí)外拉線(xiàn)使球端回至ECA,拔除插線(xiàn),結(jié)扎ECA。假手術(shù)組除不插線(xiàn)外,其余步驟同手術(shù)組。大腦中動(dòng)脈栓塞后2h恢復(fù)血供。通過(guò)神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分、大鼠存活率和四氮唑法染色評(píng)價(jià)cyna
12、ndione A抗腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。通過(guò)大鼠腦組織HE染色和DPYSL2、HMGB1免疫組織化學(xué)分析探討cynandione A神經(jīng)保護(hù)作用。
(3)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一種得到普遍認(rèn)可和應(yīng)用的多發(fā)性硬化癥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。造模方法是皮下注射MOG33-55并輔以CFA,通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞激活體內(nèi)CD4+T細(xì)胞,產(chǎn)生Th1
13、7細(xì)胞,并使之穿過(guò)血腦屏障,攻擊自身神經(jīng)髓鞘,從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)白質(zhì)脫髓鞘,引起EAE。免疫當(dāng)天記為第0天,于第0天和第2天給予各組小鼠腹腔注射400 ng/只百日咳毒素(PTX)。通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、脊髓組織HE染色、髓鞘堿性蛋白的免疫組織化學(xué)以及血漿和組織細(xì)胞因子的水平來(lái)評(píng)價(jià)兩面針堿防治實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的作用。
(4)進(jìn)一步作用機(jī)制的研究是采用基因芯片、二維電泳和計(jì)算機(jī)輔助的方法推斷兩面針堿可能的作用通路。首先確
14、定合理的給藥濃度、刺激劑劑量、給藥時(shí)間和不同種類(lèi)的細(xì)胞模型。分別考察兩面針堿對(duì)活化狀態(tài)下的骨髓細(xì)胞、骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和磁珠分選的CD4+T細(xì)胞的影響。然后驗(yàn)證三種方法推斷的兩面針堿調(diào)控的作用通路。
(5)兩面針堿作用靶標(biāo)的研究是采用生物素標(biāo)記的親和層析方法。生物素-抗生物素蛋白(biotin-avidin)系統(tǒng)常被用來(lái)尋找天然產(chǎn)物或活性小分子的靶蛋白。這種方法首先需要
15、將小分子通過(guò)連接鏈(spacer)與生物素相連,然后通過(guò)生物素與親和柱的親和力將小分子固定在親和柱上,接著在此親和柱上加入細(xì)胞提取物,與小分子有作用的蛋白就會(huì)被保留。最后,改變流動(dòng)相將靶蛋白洗脫并進(jìn)行功能和結(jié)構(gòu)確定?;谏锼?抗生物素蛋白系統(tǒng)可以尋找靶標(biāo)蛋白的性質(zhì),我們希望選擇合適的兩面針堿衍生物,通過(guò)嫁接連接臂與生物素相連獲得生物素標(biāo)記的兩面針堿衍生物,將來(lái)用于尋找與兩面針堿作用的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白。通過(guò)pulldown實(shí)驗(yàn)和weste
16、rn blot實(shí)驗(yàn)證明兩面針堿與質(zhì)譜鑒定到的蛋白的相互作用,再通過(guò)SPR和ITC等實(shí)驗(yàn)表明此蛋白與兩面針堿確實(shí)存在相互作用,從而對(duì)下游通路產(chǎn)生影響,進(jìn)一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
4、結(jié)果
第二章介紹了天然產(chǎn)物cynandione A的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制研究。首先通過(guò)細(xì)胞水平清除自由基、抗氧化和抗谷氨酸興奮毒的活性篩選,發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)活性先導(dǎo)化合物cynandione A,然后進(jìn)一步采用二維電泳和LC-MS的蛋白
17、質(zhì)組學(xué)方法研究其調(diào)控的蛋白質(zhì),結(jié)果分析cynandione A能夠下調(diào)DPYSL2和HMGB1蛋白的表達(dá),并且能抑制RAF-MEK-ERK1/2通路而起到抗谷氨酸興奮毒的保護(hù)作用。體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)該天然產(chǎn)物能夠減輕大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺失的評(píng)分,延長(zhǎng)大鼠存活率,改善大鼠腦缺血再灌注的腦組織病理學(xué),顯示出一定的抗腦缺血損傷的保護(hù)作用。并且組織分布證明cynandione A能夠透過(guò)血腦屏障。進(jìn)一步的作用機(jī)制研究表明cynandio
18、neA是通過(guò)下調(diào)DPYSL2蛋白的表達(dá)和抑制HMGB1蛋白的截留來(lái)發(fā)揮抗腦缺血的保護(hù)作用。
第三章研究了天然產(chǎn)物兩面針堿的免疫調(diào)控的作用機(jī)制和靶標(biāo)。首先在整體動(dòng)物水平發(fā)現(xiàn)兩面針堿腹腔內(nèi)注射能夠顯著推遲EAE發(fā)病時(shí)間并且減輕EAE的行為學(xué)評(píng)分。組織病理學(xué)考察發(fā)現(xiàn)兩面針堿能夠減少單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失。另外,兩面針堿顯著減少血清和組織炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-α水平,而提高抑炎性因子IL-10水平。以上結(jié)果顯示
19、兩面針堿具有抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的藥理活性。在其體內(nèi)有效的基礎(chǔ)上,我們篩選了腦脊髓炎發(fā)病過(guò)程中起到關(guān)鍵作用的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞三類(lèi)細(xì)胞,進(jìn)一步研究?jī)擅驷槈A對(duì)其的調(diào)控作用。通過(guò)活性篩選發(fā)現(xiàn)兩面針堿能夠促進(jìn)活化的樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-10,然后采用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助手段鑒定了兩面針堿的作用通路MAPK和NF-κB,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明兩面針堿能夠增強(qiáng)活化的MAPK和NF-κB通路而促進(jìn)IL-10
20、分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-10對(duì)NF-κB通路存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,從而減少炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌。另外,我們還通過(guò)采用IL-10的抗體、外源性的IL-10以及IL-10敲除實(shí)驗(yàn)證明兩面針堿是通過(guò)IL-10來(lái)緩解EAE的發(fā)病。
在天然產(chǎn)物兩面針堿的免疫調(diào)控的作用機(jī)制基礎(chǔ)上,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用親和層析的方法尋找與兩面針堿存在相互作用的蛋白質(zhì)以解釋其作用靶標(biāo),更深一層地闡明兩面針堿的作用機(jī)制。通過(guò)pulldo
21、wn實(shí)驗(yàn)和western blot實(shí)驗(yàn)證明兩面針堿可與HSP90相互作用,SPR和ITC等實(shí)驗(yàn)表明HSP90與兩面針堿確實(shí)存在相互作用。兩面針堿通過(guò)與HSP90結(jié)合,調(diào)控HSP90與某伴侶蛋白的相互作用,從而誘導(dǎo)下游通路提高IL-10的分泌,并且進(jìn)一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
5、結(jié)論
天然產(chǎn)物cynandione A能夠下調(diào)DPYSL2和HMGB1蛋白的表達(dá),并且能抑制RAF-MEK-ERK1/2通路而起到抗
22、谷氨酸興奮毒的保護(hù)作用。體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)cynandione A是通過(guò)下調(diào)DPYSL2蛋白的表達(dá)和抑制HMGB1蛋白的截留來(lái)發(fā)揮抗腦缺血的保護(hù)作用。
天然產(chǎn)物兩面針堿能夠增強(qiáng)活化的MAPK和NF-κB通路而促進(jìn)IL-10分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL-10對(duì)NF-κB通路存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,從而減少炎性因子IL-1β,IL-6和TNF-α的分泌。另外,我們還通過(guò)采用IL-10的抗體、外源性的IL-10以及IL-10敲除實(shí)驗(yàn)證明兩
23、面針堿是通過(guò)IL-10來(lái)緩解EAE的發(fā)病。進(jìn)一步的作用靶標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)兩面針堿與HSP90存在相互作用,并且兩面針堿通過(guò)與HSP90結(jié)合,調(diào)控HSP90與某伴侶蛋白的相互作用,從而誘導(dǎo)下游通路提高IL-10的分泌,并且進(jìn)一步產(chǎn)生防治EAE的作用。
這些發(fā)現(xiàn)拓展了天然產(chǎn)物cynandione A和兩面針堿在神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)控作用的認(rèn)識(shí),進(jìn)一步揭示了它們?cè)诜乐稳毖阅X卒中和多發(fā)性硬化癥方面的應(yīng)用潛力,為尋找及發(fā)現(xiàn)新的神經(jīng)保護(hù)和免疫
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