氯化兩面針堿及Wnt通路受體FZD7在CML中的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 c-Myc-microRNAs軸在氯化兩面針堿誘導的CML細胞紅系分化及凋亡中的作用及機制研究
　　研究目的:
　　研究NC對K562細胞及原代CML細胞分化和凋亡的影響，闡明NC對c-Myc及c-Myc激活的microRNAs的影響，探討NC作為治療CML藥物的可能性。
　　研究方法:
　　1.NC對K562細胞紅系分化的影響:用不同濃度NC處理K562細胞

2、后，應用聯苯胺染色法檢測細胞的分化率.
　　2.NC對K562細胞凋亡的影響:用不同濃度NC處理K562細胞24或48小時后，MTT法檢測細胞存活;AnnexinⅤ/PI雙染后流式細胞術檢測細胞凋亡.
　　3.C-Myc在NC誘導的紅系分化及凋亡中的作用:首先應用Western blot和real-time RT-PCR檢測NC對c-Myc蛋白和mRNA水平的影響.
　　4.NC對c-Myc降解的影響極其作用機制:我們

3、應用Westernblot檢測NC對c-Myc Thr58磷酸化水平的影響.
　　5.C-Myc激活的microRNAs在NC誘導的紅系分化及凋亡中的作用:應用Real-time RT-PCR方法檢測NC處理或下調c-Myc對K562細胞中c-Myc相關microRNAs表達的影響.
　　6.NC對K562、K562/G01的IM敏感性的影響:用NC、IM或NC+IM處理K562細胞后，軟瓊脂集落形成實驗觀察NC、IM或二者

4、聯合作用對K562集落形成能力的影響.
　　7.NC對原代CML細胞的影響:收集5例CML患者骨髓，分離單個核細胞，其中病例1-3為IM敏感型，4和5為IM耐藥型。
　　研究結果:
　　1.NC對K562細胞紅系分化的影響:應用聯苯胺染色實驗顯示NC可明顯增加K562細胞的分化率，且其誘導分化效應具有時間、劑量反應關系。
　　2.NC對K562細胞凋亡的影響:MTT結果顯示NC可抑制K562的生長。
　　3

5、.c-Myc在NC誘導的K562紅系分化及凋亡中的作用:原癌基因c-Myc通路在白血病細胞增殖、分化及凋亡等多種生物學行為中起重要作用，我們發(fā)現NC可下調c-Myc蛋白的表達，且具有時間、劑量反應關系。
　　4.NC對c-Myc降解的影響極其作用機制:NC對c-Myc mRNA的影響不具有顯著性，由此推測NC對c-Myc的調控發(fā)生在轉錄后水平,NC通過上調T58磷酸化加速c-Myc的降解。
　　5.c-Myc激活的micro

6、RNAs在NC誘導的紅系分化及凋亡中的作用:miR-17和miR-20a上調可逆轉NC誘導的globinγ水平升高及細胞凋亡，由此可見，NC誘導的K562紅系分化及凋亡是通過下調miR-17、miR-20a起作用的。
　　6.NC對K562、K562/G01對伊馬替尼的敏感性的影響:NC、IM或聯合(NC+IM)均可下調K562集落形成能力，且NC可增加IM的效力。K562/G01為伊馬替尼不敏感，但NC對仍有殺傷作用，且NC可增

7、加伊馬替尼誘導的K562/G01細胞凋亡。
　　7.NC對原代CML細胞的影響:NC可誘導原代CML細胞凋亡，并增加其對伊馬替尼敏感性，更重要的是，NC對伊馬替尼耐藥的細胞仍具有殺傷作。NC可下調原代CML細胞中c-Myc蛋白及miR-17和miR-20a的表達。
　　結論:
　　1.NC可誘導K562細胞紅系分化和凋亡;
　　2.NC通過增加Thr58磷酸化水平加快c-Myc的降解，并可下調c-Myc激活的mi

8、RNAs;
　　3.NC對伊馬替尼耐藥的K562/G01細胞及原代CML細胞仍有殺傷作用;
　　4.NC可能成為一個新的抗白血病藥物，為CML的治療提供新的方案及實驗室基礎。
　　第二部分 Wnt通路分子FZD7在CML中的表達及其在骨髓基質細胞介導耐藥中作用
　　研究目的:
　　研究FZD7在CML患者中的表達水平;探討FZD7異常表達對白血病細胞藥物敏感性及藥物誘導凋亡的影響;闡明FZD7在BMSCs介

9、導的IM耐藥中的作用，為逆轉IM多藥耐藥提供新的靶點。
　　研究方法:
　　1.收集16例初診未經TKIs治療的CML患者及6例正常對照骨髓標本，磁珠分選CD34+細胞，Real-time RT-PCR檢測CD34+細胞中10種FZD分子的表達情況。16例CML患者根據治療后情況，分為伊馬替尼敏感(imatinib sensitive，IMS)組（9例）和伊馬替尼抵抗(imatinib resistant，IMR)組（7例）

10、，分析兩組間FZD7分子的表達差異。
　　2.我們收集了3例CML（C1、C2和C3）及2例正常對照(N1和N2)骨髓標本，體外培養(yǎng)BMSCs細胞，并將其與CML細胞共培養(yǎng)后，Western blot方法檢測CML細胞中FZD7、β-catenin和MDR1的等Wnt通路分子的蛋白水平改變;Real-time RT-PCR檢測CML細胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA

11、水平的改變。
　　3.包裝攜帶FZD7 shRNA的慢病毒，感染K562細胞72小時后熒光顯微鏡觀測感染效率，用Real-time RT-PCR和Western blot方法檢測病毒感染后FZD7下調情況。
　　4.細胞增殖檢測:MTT方法檢測FZD7下調對細胞的增殖的影響;PI染色后利用流式細胞儀檢測FZD7對細胞周期的改變。
　　5.IM的敏感性檢測:將感染后的細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的IM，培養(yǎng)48或

12、72小時，MTT方法檢測細胞對IM的敏感性，計算伊馬替尼的半數抑制濃度(IC50); AnnexinⅤ/PI雙染后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率的變化。
　　6.將感染了ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒的K562細胞與不同來源的BMSCs共培養(yǎng)48小時后，采用標準洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細胞，加入伊馬替尼(0.2μM)處理48小時，應用MTT檢測細胞存活率，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。
　　7.用ShFZD7-2或S

13、hCtrl慢病毒感染K562細胞72小時后，與不同來源的BMSCs共培養(yǎng)48小時后，采用標準洗滌方法收集共培養(yǎng)后的K562細胞，應用Westernblot和Real-time RT-PCR檢測FZD7及Wnt下游基因的表達情況。
　　研究結果:
　　1.CML患者中FZD7表達情況:相對于正常CD34+細胞，CML CD34+細胞中FZD7表達升高。
　　2.BMSCs與CML細胞系K562及原代CML細胞直接共培養(yǎng)后

14、，K562及原代CML細胞中FZD7、β-catenin和MDR1的蛋白表達水平較單獨培養(yǎng)組明顯升高，并且CML來源的BMSCs較正常對照來源的BMSCs對CML細胞中Wnt/β-catenin信號激活更為顯著。此外，Real-time RT-PCR結果顯示BMSCs與CML細胞系K562共培養(yǎng)后，CML細胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA表達水平較單獨培養(yǎng)組亦明顯增高。<

15、br>　　3.包裝FZD7 shRNA慢病毒并感染K562細胞72小時后，熒光顯微鏡觀察感染效率達95％以上，Real-time RT-PCR和Western blot結果顯示攜帶FZD7 shRNA的慢病毒可有效下調FZD7表達。
　　4.FZD7下調抑制CML增殖:MTT結果顯示，FZD7干擾組的增殖速率顯著低于對照組。
　　5.FZD7下調增加CML細胞對伊馬替尼的敏感性:MTT檢測發(fā)現，干擾FZD7表達后K562細胞

16、對IM的敏感性的增加。流式細胞術檢測細胞凋亡率結果顯示，下調FZD7后IM的誘導凋亡率顯著升高。Western blot結果表明FZD7干擾組caspase3及PARP-1的活性片段表達上調。
　　6.FZD7下調能減少BMSCs誘導的伊馬替尼耐藥:MTT結果顯示，FZD7下調顯著抑制BMSCs誘導的IM耐藥。流式細胞術檢測細胞凋亡發(fā)現，在共培養(yǎng)的K562細胞中下調FZD7后IM的誘導凋亡率顯著升高。
　　7.FZD7下調能

17、減少BMSCs誘導的Wnt/β-catenin信號通路激活:Western blot結果顯示，FZD7下調能有效逆轉BMSCs誘導的FZD7和MDR1蛋白上調;Real-time RT-PCR檢測結果顯示，FZD7下調能抑制BMSCs介導的MDR1和CD44 mRNA水平升高。由此可見，FZD7高表達可能是共培養(yǎng)后Wnt/β-catenin信號通路激活的原因。
　　結論:
　　1.相對于正常CD34+細胞，CML CD34+