枇杷花藥胚狀體的發(fā)生組織學(xué)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和EMS誘變研究.pdf

1、本試驗從組織學(xué)方面研究枇杷花藥胚狀體的起源，探討以枇杷花藥胚狀體為受體進行外源基因的轉(zhuǎn)化方法，初步建立以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的枇杷花藥胚狀體為受體的外源基因轉(zhuǎn)化方法，將外源基因CycD2引入了枇杷。同時以枇杷花藥胚狀體為材料，采用不同濃度的EMS和不同處理時間進行化學(xué)誘變，并對誘變處理后的枇杷花藥胚狀體進行RAPD分析，旨在獲得突變體，為豐富枇杷育種新材料奠定一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1．組織學(xué)研究證實，花藥胚的發(fā)育經(jīng)歷球形胚

2、，心形胚，魚雷形胚及子葉形胚的發(fā)育歷程。在心形期與魚雷形期胚之間，胚內(nèi)開始形成維管束組織；到魚雷形期，維管束組織進一步發(fā)育，開始形成V字形維管束；當(dāng)胚發(fā)育到子葉形期時，維管束組織進一步完善，形成明顯的V字形維管束。 次生胚發(fā)生以間接途徑進行時，次生胚發(fā)生的起源為內(nèi)起源。在愈傷組織內(nèi)部，胚性細胞(染色過程中著色深，具有明顯的細胞核，體積較小，細胞結(jié)構(gòu)緊密，細胞質(zhì)濃，分裂旺盛)的細胞壁增厚，與其它細胞隔離開，形成相對獨立的單細胞原胚

3、或多細胞原胚；緊接著細胞進行分裂，形成二細胞原胚、四細胞原胚和多細胞原胚。胚性細胞在進行第一次分裂后就建立了極性，分裂形成的胚性細胞團內(nèi)部結(jié)構(gòu)緊密，與周圍其它細胞相對隔離。 當(dāng)次生胚發(fā)生以直接接途徑進行時，次生胚發(fā)生的起源為外起源。即在子葉胚的中胚軸到下胚軸之間的表皮細胞開始分裂，分化形成胚性細胞，胚性細胞分化形成二細胞原胚，四細胞原胚及多細胞原胚，多細胞原胚進一步分化，在胚的中胚軸到下胚軸的表明形成凸起的球形胚，球形胚進一步發(fā)

4、育形成心形胚，魚雷形胚及子葉形胚。 2．安必西林適用于對轉(zhuǎn)化枇杷花藥胚狀體的篩選。枇杷花藥胚狀體與農(nóng)桿菌EHA52共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基上，所選用的四種抗菌素中安必西林、噻孢霉素和硫酸慶大霉素對農(nóng)桿菌的抑制效果較好，羧芐青霉素不能有效抑制農(nóng)桿菌EHA52的生長。與不含抗菌素的培養(yǎng)基相比，抗菌素的加入均降低枇杷花藥胚狀體的增殖率。安必西林在所測試的幾種抗菌素中不僅能很好的控制農(nóng)桿菌EHA52的生長，而且對枇杷花藥胚狀體的生長和增

5、殖影響最小，噻孢霉素次之。硫酸慶大霉素雖然能夠很好地控制農(nóng)桿菌EHA52的生長，但是由于它對枇杷花藥胚狀體有很強的毒害作用，導(dǎo)致枇杷花藥胚狀體褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，生長和增殖都都受到嚴(yán)重影響，故不適用于對轉(zhuǎn)化枇杷花藥胚狀體的選擇。綜合各種因素認(rèn)為安必西林的濃度在500mg/L～1000 mg/L適用于對轉(zhuǎn)化枇杷花藥胚狀體的篩選。 3.CycD2基因被成功轉(zhuǎn)入了枇杷花藥胚狀體。轉(zhuǎn)化后的枇杷花藥胚狀體增殖，采用CycD2特異引物對次生胚DN

6、A進行PCR擴增，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒CycD2的農(nóng)桿菌DNA，經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化后的枇杷花藥胚狀體DNA在500～600bp有譜帶，而沒有經(jīng)過轉(zhuǎn)化的枇杷花藥胚狀體的DNA則沒有相應(yīng)的譜帶，表明CycD2基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入枇杷花藥胚狀體中。 4.經(jīng)過EMS處理的枇杷花藥胚狀體生長和增殖能力下降。將枇杷花藥胚狀體轉(zhuǎn)入到含0.1％～0.9％EMS的溶液中振蕩0.5h，1h和2h。轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中觀察發(fā)現(xiàn)枇杷花藥胚狀體的死亡率很高，多數(shù)花藥胚狀體表面

7、變黑，褐化死亡，0.3％EMS處理0.5h的存活率最高為46.8％，0.7％EMS處理2h的枇杷花藥胚狀體存活率最低為2.8％。經(jīng)過EMS處理的枇杷花藥胚狀體增殖能力顯著低于未經(jīng)過處理的枇杷花藥胚狀體，分化的次生胚的生長和分化能力也變?nèi)酰瑫r分化的次生胚多以球形胚為主。 5.經(jīng)過EMS處理的枇杷花藥胚狀體增殖，提取DNA，進行RAPD分析。經(jīng)檢測，發(fā)現(xiàn)一些誘變處理過的胚狀體擴增的譜帶與對照譜帶發(fā)生了變化。從擴增圖譜可以看出：以s