體外誘導(dǎo)hASC向胰島樣細(xì)胞團(tuán)分化及其移植治療Ⅰ型糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　 人脂肪來源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：
　　 分離、純化人脂肪來源的干細(xì)胞（human adipose tissue-derived stem cell，hASC）并鑒定其生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 采用zuk等建立的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法：借助普通外科手術(shù)獲得脂肪組織；分離、純化脂肪來源干細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)分析第四代細(xì)胞表面標(biāo)志和胞漿抗原表達(dá)；繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲

2、線；借助端粒酶活性檢測(cè)，評(píng)價(jià)其體外增殖能力；借助吉姆薩染色，分析第4、8、12、16代細(xì)胞染色體核型，評(píng)價(jià)干細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性；雙層瓊脂培養(yǎng)檢測(cè)干細(xì)胞成瘤性。
　　 結(jié)果：
　　 在培養(yǎng)第四代始，細(xì)胞出現(xiàn)均一的旋渦狀生長(zhǎng)，增殖速度較快。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，第四代細(xì)胞表達(dá)CD73(99.1％)、CD90(97.9％)、CD105(97.2％),符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)胞倍增時(shí)間約為36小時(shí)。染色體核型分析顯示

3、，hASCs為正常二倍體核型，G顯帶檢測(cè)未見異常。體外雙層瓊脂檢測(cè)未見成瘤性。
　　 結(jié)論：
　　 hASC經(jīng)分離、純化，可在體外有效擴(kuò)增，符合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和公認(rèn)的干細(xì)胞特征。體外培養(yǎng)過程，hASC不表達(dá)胰腺相關(guān)標(biāo)志物，染色體核型穩(wěn)定且無變異，未見成瘤性。
　　 第二部分：胎胰蛋白/損傷胰腺蛋白復(fù)合物誘導(dǎo)hASC向胰腺方向的分化
　　 目的：
　　 評(píng)價(jià)大鼠胚胎胰腺/損

4、傷胰腺組織的可溶性蛋白提取物誘導(dǎo)hASC向胰島素分泌細(xì)胞分化的能力。
　　 方法：
　　 制備大鼠胚胎胰腺/損傷胰腺的蛋白勻漿，提取可溶性細(xì)胞因子復(fù)合物，與hASC共培養(yǎng)20天，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)胰腺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平和胰島素/C肽分泌水平。
　　 結(jié)果：
　　 胚胎胰腺/損傷胰腺的蛋白提取物，可誘導(dǎo)hASC表達(dá)與胰腺發(fā)育密切相關(guān)的基因產(chǎn)物（如PDX-1、Pax-4、Pax-6等），部分分化細(xì)胞可表達(dá)胰島

5、素和C肽。
　　 結(jié)論：
　　 提示損傷胰腺和胚胎胰腺內(nèi)富含胰腺發(fā)育相關(guān)蛋白，可誘導(dǎo)hASC向胰腺方向分化，并最終誘生胰島素、C-肽陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 第三部分胰島新生相關(guān)蛋白肽方案促進(jìn)hASC向胰腺方向的深度分化
　　 目的：
　　 評(píng)價(jià)胰島新生相關(guān)蛋白肽4步方案誘導(dǎo)hASC分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)的效果。
　　 方法：
　　 應(yīng)用胰島新生蛋白肽聯(lián)合胰腺發(fā)育相關(guān)細(xì)胞因子及化學(xué)因子進(jìn)行四步

6、誘導(dǎo)，RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞胰腺發(fā)育及功能基因表達(dá)的改變，在不同濃度（5.6mM、25mM）葡萄糖刺激下，檢測(cè)分化細(xì)胞胰島素及C肽分泌量，評(píng)價(jià)細(xì)胞的葡萄糖應(yīng)激能力。
　　 結(jié)果：
　　 誘導(dǎo)過程中，hASC的干細(xì)胞相關(guān)基因Oct3/4表達(dá)降低至原始水平的1/20,而與胰腺系分化發(fā)育相關(guān)的基因（如ck19、nestin、PDX-1、nkx2.2等）表達(dá)水平均顯著升高。誘導(dǎo)分化后期，INGA

7、P-pp誘導(dǎo)組出現(xiàn)直徑約150～200μm的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，Scramble-pp誘導(dǎo)組出現(xiàn)直徑約50～100μm的胰島樣細(xì)胞團(tuán)，前者更接近天然胰島的直徑。免疫熒光檢測(cè)顯示，INGAP-pp所誘生的胰島樣細(xì)胞團(tuán)內(nèi)存在胰島素和C肽雙陽(yáng)性細(xì)胞群，可對(duì)不同濃度葡萄糖刺激產(chǎn)生反應(yīng)，分泌量約占天然胰島細(xì)胞1/10～1/15。
　　 結(jié)論：
　　 INGAP-pp誘導(dǎo)方案可經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的途徑，誘導(dǎo)hASC向胰腺系細(xì)胞分化，

8、在體外形成具有胰島素分泌功能的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。雖然與天然胰島相比尚不完善，但提示在適當(dāng)條件誘導(dǎo)下，hASC確可分化為具有葡萄糖應(yīng)激能力的胰島樣細(xì)胞。
　　 第四部分胰島樣細(xì)胞團(tuán)移植治療糖尿病大鼠的效果評(píng)價(jià)
　　 目的：
　　 評(píng)價(jià)純化INGAP-pp蛋白及INGAP-pp誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的ILC移植治療糖尿病大鼠的效果。
　　 方法：
　　 STZ誘導(dǎo)大鼠I型糖尿病模型，在體視鏡下新鮮分離人胰島及ING

9、AP-pp誘導(dǎo)組所產(chǎn)生ILC各200個(gè)，分別移植于糖尿病大鼠模型左腎包膜下，比較正常胰島移植組、ILC移植組、INGAP-pp蛋白注射組、糖尿病組及正常大鼠組在實(shí)驗(yàn)周期的血糖水平，每3天檢測(cè)1次。對(duì)各組進(jìn)行腹腔內(nèi)葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)各組存活率。
　　 結(jié)果：
　　 移植正常人胰島的糖尿病大鼠血糖水平趨于正常，與正常大鼠血糖接近；移植ILC的糖尿病大鼠組血糖水平在術(shù)后短暫上升，遂即下降，并在稍高于正常大鼠血糖水平保持穩(wěn)

10、定；注射INGAP-pp蛋白的糖尿病大鼠在注射過程中血糖下降，停止注射蛋白后緩慢回升；糖尿病大鼠組血糖持續(xù)異常，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。腹腔內(nèi)葡萄糖應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，移植第20天，移植正常胰島和ILC的糖尿病大鼠均出現(xiàn)接近于正常大鼠的反應(yīng)曲線，但I(xiàn)LC移植組血糖水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于胰島移植組。由于血糖持續(xù)波動(dòng)，INGAP-pp蛋白注射組未進(jìn)行葡萄糖應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。另外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，糖尿病組大鼠逐漸死亡，至51天全部死亡；整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中胰島移植組和ILC移植