細(xì)胞外熱休克蛋白70對(duì)小鼠血清血管生成素-2水平及肺血管通透性的影響.pdf

1、[目的]
　　最新研究表明:機(jī)體在受到創(chuàng)傷后，能釋放一類(lèi)具有免疫活性調(diào)節(jié)作用的內(nèi)源性物質(zhì)稱(chēng)為損傷相關(guān)模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）分子[1]。肺內(nèi)皮細(xì)胞是肺部創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞，其中血管生成素2(Ang-2)是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的重要生物標(biāo)記物。本課題前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):細(xì)胞外熱休克蛋白70(eHSP70)可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2合成及分泌增加。此效應(yīng)可能通過(guò)eHS

2、P70與內(nèi)皮細(xì)胞表面上的Toll樣受體2(TLR2)等多種受體結(jié)合發(fā)揮其作用。因此，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步探討:1、eHSP70是否對(duì)小鼠肺血管通透性及肺組織病理產(chǎn)生影響;2、eHSP70是否影響小鼠血清Ang-2水平;3、初步探討eHSP70在體內(nèi)引起Ang-2濃度變化的調(diào)節(jié)機(jī)制。這些研究將為尋找創(chuàng)傷后內(nèi)皮功能障礙治療的新手段提供理論依據(jù)。
　　[方法]
　　本課題分兩部分實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。第一部分實(shí)驗(yàn)分組，選取6-8周齡SPF級(jí)雄性昆明

3、小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、eHSP70組、eHSP70+TL2.1(TLR2阻滯劑)組;第二部分實(shí)驗(yàn)分組，選取6-8周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、eHSP70組、 eHSP70+PMSF(磷脂酶C阻滯劑)組。藥物使用方法及劑量分別如下:eHSP70按0.022μg/g劑量經(jīng)鼠尾靜脈注射，TLR2阻滯劑按1.5mg/kg劑量亦經(jīng)鼠尾靜脈注射，而磷脂酶C(PLC)阻滯劑需在使用eHSP70前30分鐘按30mg/kg劑量予

4、以腹腔注射。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)12小時(shí)前禁食，6小時(shí)前禁水。治療后恢復(fù)正常飲食。觀(guān)察6小時(shí)后麻醉收集小鼠血液（眼球采血）用ELISA測(cè)定小鼠血清Ang-2濃度;開(kāi)胸取左肺組織用HE染色觀(guān)察小鼠肺組織病理改變、用免疫組化法測(cè)定肺組織TLR2及PLC蛋白表達(dá)量，取右肺組織用伊文思藍(lán)法測(cè)定小鼠肺血管通透性。應(yīng)用SPSS20.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用(x)±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

5、。
　　[結(jié)果]
　　1、各組小鼠肺血管通透性評(píng)估
　　第一部分實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比，eHSP70組伊文思藍(lán)漏出量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（10.61±1.59 VS79.26±7.45，P＜0.05）。eHSP70+TL2.1組伊文思藍(lán)漏出量低于eHSP70組（53.13±7.10 VS79.26±7.45，P＜0.05），但仍高于對(duì)照組(53.13±7.10 VS10.61±1.59，P＜0.05)。
　　第二

6、部分實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比，eHSP70組伊文思藍(lán)漏出量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10.89±1.60 VS81.67±9.13，P＜0.05)。eHSP70+PMSF組伊文思藍(lán)漏出量低于eHSP70組（42.16±8.66 VS81.67±9.13，P＜0.05），但仍高于對(duì)照組(42.16±8.66 VS10.89±1.60, P＜0.05)。
　　2、各組小鼠血清Ang-2濃度變化
　　第一部分實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組比較，eHSP

7、70組Ang-2濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.88±1.36ng/ ml VS2.65±0.47ng/ml，P＜0.05)。與eHSP70組對(duì)比，eHSP70+TL2.1組Ang-2濃度顯著減少(8.10±1.01ng/ml VS13.88±1.36ng/ml，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(8.10±1.01 ng/ml VS2.65±0.47ng/ml，P＜0.05)。
　　第二部分實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組比較，eHSP70組

8、Ang-2濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(13.96±1.23ng/ml VS2.66±0.51ng/ml，P＜0.05)。與eHSP70組對(duì)比，eHSP70+ PMSF組Ang-2濃度顯著減少(10.85±1.00ng/ml VS13.96±1.23ng/ml，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組（10.85±1.00ng/ml VS2.66±051ng/ml，P＜0.05）。
　　3、各組小鼠肺組織病理變化
　　第一部分實(shí)驗(yàn)

9、:eHSP70組病理評(píng)分高于對(duì)照組(5.67±0.52 VS1±0.63，P＜0.05); eHSP70+TL2.1組病理分?jǐn)?shù)低于eHSP70組(3.17±0.41 VS5.67±0.52，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組（3.17±0.41 VS1±0.63，P＜0.05）。
　　第二部分實(shí)驗(yàn):eHSP70組病理評(píng)分高于對(duì)照組(6.33±0.52 VS1.12±0.75，P＜0.05);eHSP70+PMSF組病理分?jǐn)?shù)也低于eHS

10、P70組(3.5±0.55 VS6.33±0.52，P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組（3.5±0.55 VS1.12±0.75，P＜0.05）。
　　4、第一部分小鼠肺組織TLR2蛋白表達(dá)水平
　　對(duì)照組TLR2蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá);TLR2蛋白在eHSP70組內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，為強(qiáng)陽(yáng)性。預(yù)處理TL2.1后，eHSP70+TL2.1組TLR2蛋白的表達(dá)水平均較eHSP70組下降。
　　5、第二部分小鼠肺組織PLC蛋白

11、表達(dá)水平
　　對(duì)照組PLC蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá);PLC蛋白在eHSP70組內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)顯著增強(qiáng)，為強(qiáng)陽(yáng)性。預(yù)處理PMSF后，eHSP70+ PMSF組PLC蛋白的表達(dá)水平均較eHSP70組下降。
　　[結(jié)論]
　　1、eHSP70可以導(dǎo)致小鼠肺血管通透性增加，引起肺組織出現(xiàn)肺水腫及炎癥滲出;
　　2、eHSP70可以誘導(dǎo)小鼠血清Ang-2水平增高;
　　3、eHSP70可能通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞表面上的TLR2和P