基于α--FR的配體探針PCR檢測(cè)腎細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床意義.pdf

1、南方醫(yī)科大學(xué)2011級(jí)碩士學(xué)位論文基于Q—FR的配體探針PCR檢測(cè)腎細(xì)胞癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床意義PreliminaryInvestigationoftheClinicalSignificanceofDetectingCirculatingTumorCellsfromRenalCellsCarcinomaPatientsthrough‘‘LigandProbe’’PCRbasedon僅FR課題來源：自選課題學(xué)位申請(qǐng)人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培

2、養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院張磊劉春曉外科學(xué)(泌尿外科)專業(yè)型醫(yī)學(xué)碩士第二臨床醫(yī)學(xué)院2014年5月12日廣州摘要酸組成，分子量約38kDa。其在J下常上皮細(xì)胞中表達(dá)極其有限，而在上皮來源的惡性腫瘤中過度表達(dá)；文獻(xiàn)報(bào)道超過75％的RCC其C【FR呈高度表達(dá)。目前有關(guān)腎細(xì)胞癌CTCs的研究相對(duì)較少，主要原因在于檢測(cè)手段的限制；例如常見的RTPCR，CellSearch系統(tǒng)及流式細(xì)胞儀等CTCs檢測(cè)手段并非適合于RCC。因此，本研究在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)

3、上先從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)0【FR在兩種人腎癌細(xì)胞株ACHN、7860中的表達(dá)情況；再嘗試采用基于0【一FR的配體探針PCR技術(shù)來有效檢測(cè)RCC患者外周血CTCs，初步闡述RCC患者外周血CTCs檢測(cè)的臨床意義。為RCC患者檢測(cè)外周血CTCs提供了一種切實(shí)可行的技術(shù)手段，國內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。目的：探索基于q—FR的配體探針PCR定量檢測(cè)腎細(xì)胞癌(RCC)患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)的可行性，并進(jìn)一步闡釋該法定量檢測(cè)RCC患者外

4、周血CTCs的臨床意義。方法：一：(1)：選擇兩株人腎癌細(xì)胞株ACHN、7860，采用含10％FBS的無葉酸培養(yǎng)基RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化收集。另取健康志愿者外周血收集白細(xì)胞做陰性對(duì)照。Trizol提取三種細(xì)胞總RNA，常規(guī)凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；采用商品化試劑盒(PrimescriptTMRTMasterMixKit)對(duì)目的基因(ct—FR)進(jìn)行特異性擴(kuò)增，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。制作溶解曲線及擴(kuò)增曲線，采用

5、AAt法行相對(duì)定量分析；并紫外燈下觀察凝膠電泳后的擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)：取106的三種細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA法行蛋白定量檢測(cè)，Westernblot法檢測(cè)蛋白樣品中QFR的表達(dá)情況；GAPDH作內(nèi)參，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)，分析表達(dá)差異。(3)：為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法能敏感而有效地從外周血中檢測(cè)到CTCs，我們將培養(yǎng)的人腎癌細(xì)胞株ACHN進(jìn)行人工摻血實(shí)驗(yàn)。重懸細(xì)胞分為5／ul、50／ul、500／ul、5000／ul和50000／ul五個(gè)