光照改變對金黃地鼠下丘腦-垂體-性腺軸影響的觀察.pdf

1、目的:采用褪黑素分泌晝夜節(jié)律明顯的金黃地鼠為研究對象，觀察光照強(qiáng)度、光照時(shí)間對金黃地鼠下丘腦-垂體-性腺軸及相關(guān)因子的影響，尤其是中樞下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)神經(jīng)肽及其受體的影響;探討光信號改變誘發(fā)的動(dòng)物中醫(yī)證型初步符合“陰虛火旺”證型，為后期“以藥測證”反證該證型提供動(dòng)物模型。
　　方法:2日齡雌性、雄性金黃地鼠各4窩，隨機(jī)分為正常組(N，50lux)、16小時(shí)弱光組(M1，50lux)、16小時(shí)強(qiáng)光組(M2，350lux)、和

2、20小時(shí)強(qiáng)光組(M3，350lux)，每組10只幼鼠，1只母鼠;21日齡斷乳后每只金黃地鼠分別單獨(dú)喂養(yǎng)于特制鼠籠，體積為50cm×40cm×30cm。
　　全部采用人工光照、隔離太陽光，動(dòng)物架上每層置40W日光燈1盞，每個(gè)房間單獨(dú)使用定時(shí)器進(jìn)行光照條件的控制，正常組固定于早上7:00開始光照，19:00熄燈(12h/12h:12light/12dark)，光照強(qiáng)度為50lux;16小時(shí)弱光組固定于早上3點(diǎn)開始光照，19:00熄燈(

3、16h/8h:16light/8dark)，光照強(qiáng)度為50lux;16小時(shí)強(qiáng)光組固定于早上3點(diǎn)開始光照，19:00熄燈(16h/8h:16light/8dark)，調(diào)整鼠籠與燈的距離，光強(qiáng)度控制在350lux;20小時(shí)強(qiáng)光組固定于早上1點(diǎn)開始光照，20:00熄燈(20h/4h:20light/4dark)，光強(qiáng)度控制在350lux。
　　從金黃地鼠2日齡持續(xù)光照干預(yù)至28日齡，在金黃地鼠28日齡時(shí)取外周血、下丘腦、垂體、卵巢以及子

4、宮，計(jì)算體重增長水平、子宮、卵巢、睪丸濕重及其器官指數(shù)，采用Real-time PCR法檢測金黃地鼠下丘腦GnRH、GnIH、Mel1c，垂體GnRHR(GPR54)、GnIHR(GPR147)以及子宮、卵巢、睪丸GnRHR的mRNA表達(dá)變化;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSSl3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　一、光照對金黃地鼠一般情況、外周性腺相關(guān)指標(biāo)的影響雌性:
　　①一般情況:光照組出現(xiàn)明顯的躁動(dòng)不安、易激惹狀態(tài)，皮毛光

5、澤度較正常組差，進(jìn)食量、飲水量減少，并且M3組體重增加幅度明顯大于正常組(P=0.05);而M1組和M2組體重增長幅度顯著落后于正常組(P＜0.05);
　?、谛云鞴贊裰丶捌淦鞴僦笖?shù):M1組子宮濕重（0.072±0.01g）、卵巢濕重（0.038±0.00g）、子宮指數(shù)（13.77±3.2）、卵巢指數(shù)（7.15±0.8）與N組子宮濕重（0.067±0.02g）、卵巢濕重（0.032±0.01g）、子宮指數(shù)（12.66±4.3）、卵

6、巢指數(shù)（5.72±2.2）比較P值分別為0.658、0.055、0.553、0.07; M2組子宮濕重（0.047±0.02g）、卵巢濕重（0.030±0.01g）、子宮指數(shù)（8.87±2.9）、卵巢指數(shù)（5.77±1.2）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.099，0.353，0.058，0.916; M3組子宮濕重（0.057±0.02g）、卵巢濕重（0.029±0.01g）、子宮指數(shù)（12.72±3.4）、卵巢指數(shù)（6.28±0.8）

7、與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.134，0.297，0.857，0.537;M2組與M1組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.014、0.012、0.015、0.094; M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.237、0.913、0.043、0.504。
　　③性發(fā)育相關(guān)激素水平:實(shí)驗(yàn)組E2水平顯著落后N組E2水平，M1組E2水平（66.81±16.1 pg/ml）與N組（95.25±25.79 pg/ml）比較P值為0.002; M2組

8、E2水平（72.57±15.21 pg/ml）與N組比較P值為0.021，0.867，0.093;M3組E2水平（73.75±20.72 pg/ml）N組比較P值為0.030，0.974，0.529; M2組E2水平與M1組比較P值為0.491;M3組E2水平與M2組比較P值為0.899。FSH、LH組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?、茏訉m、卵巢HE切片分析:M1組子宮內(nèi)膜上皮(87.6±6.64μm)、子宮內(nèi)膜（261.67±21.8

9、2μm）、子宮肌層（145.51±16.07μm）、最大卵泡直徑（286.92±21.00μm）與N組子宮內(nèi)膜上皮（70.42±4.35μm）、子宮內(nèi)膜（248.38±18.05μm）、子宮肌層（156.84±10.65μm）、最大卵泡直徑（249.22±10.13μm）相比P值分別為0.083、0.648、0.579、0.115; M2組子宮內(nèi)膜上皮（86.19±7.15μm）、子宮內(nèi)膜（229.88±16.87μm）、子宮肌層（11

10、3.86±10.40μm）、最大卵泡直徑（260.95±22.40μm）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.074,0.462，0.009，0.596;M3組子宮內(nèi)膜上皮（97.94±7.84μm）、子宮內(nèi)膜（288.00±21.36μm）、子宮肌層(142.08±19.11μm)、最大卵泡直徑（315.43±17.53μm）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.006，0.184，0.497，0.001;M2組與M1組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.

11、884、0.278、0.157、0.325; M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.239、0.054、0.206、0.039。
　　雄性:
　　①一般情況:與雌性金黃地鼠出現(xiàn)類似的精神、毛色改變;斷乳后（21日齡）持續(xù)干預(yù)至地鼠28日齡，體重增長幅度M1組（17.63±4.07）、M2組（14.23±2.06）、M3組（19.07±3.43）與N組（26.71±3.09）比較P值均小于0.001;
　　②性器官濕重

12、及其器官指數(shù):M1組睪丸濕重（0.57±0.05g）、睪丸指數(shù)（102.2±7.0）與N組睪丸濕重（0.57±0.03g）、睪丸指數(shù)（93.6±3.4）比較相應(yīng)P值為0.444、0.176;M2組睪丸濕重（0.59±0.03g）、睪丸指數(shù)（103.1±3.7）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.594，0.88;M3組睪丸濕重（0.69±0.03g）、睪丸指數(shù)（117.0±3.4）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.015，0.004; M2組

13、與M1組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.241、0.176; M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.053、0.29。
　?、坌园l(fā)育相關(guān)激素水平:M1組外周血T（1.21±0.24 ng/ml）、FSH(21.41±1.22mIU/ml)、LH（52.86±2.07mIU/ml）與N組T（0.79±0.07 ng/ml）、FSH(21.75±0.55mIU/ml)、LH（51.19±0.82 mIU/ml）比較P值分別為0.031、0

14、.289、0.084;M2組外周血T(1.14±0.13 ng/ml)、FSH（20.56±0.80 mIU/ml）、LH（51.37±3.13 mIU/ml）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.014，0.220，0.889; M3組外周血T(1.08±0.11ng/ml)、FSH（21.31±0.35 mIU/ml）、LH（50.84±3.48 mIU/ml）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.034，0.596，0.765; M2組與M1

15、組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.529、0.276、0.152; M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.652、0.73、0.656;
　　④睪丸HE切片分析:睪丸HE切片發(fā)現(xiàn)正常組睪丸生精上皮形態(tài)良好，不同發(fā)育階段生精細(xì)胞有序排列，分別為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞，尚未出現(xiàn)成熟的精子細(xì)胞。光照組睪丸生精上皮基本形態(tài)良好，未出現(xiàn)病理性損傷，生精細(xì)胞發(fā)育良好，未出現(xiàn)成熟的精子。
　　二、光照對金黃地鼠HPG軸

16、相關(guān)神經(jīng)肽及其受體mRNA水平的影響
　　雌性:
　?、傧虑鹉XGnRH、GnIH以及Mel1c mRNA表達(dá):M1組下丘腦GnRH(0.17±0.05)、GnIH（10.68±3.11）、Mel1c(0.15±0.03) mRNA與N組下丘腦GnRH(0.55±0.22)、GnIH（4.48±1.14）、Mel1c(0.45±0.08)mRNA比較P值分別為0.217、0.121、0.004;M2組下丘腦GnRH（0.28±

17、0.03）、GnIH(11.92±0.69)、Mel1c(0.19±0.05)mRNA與與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.331，0.001，0.026; M2組相應(yīng)參數(shù)與M1組比較P值分別為0.741、0.139、0.530。
　?、诖贵wGPR54、GPR147 mRNA表達(dá):M1組垂體GnRHR(237.13±34.3)、GnIHR（0.084±0.038）mRNA與N組垂體GnRHR（171.69±45.1）、GnIHR（1.

18、96±1.21）mRNA比較P值分別為0.142、0.366;M2組垂體GnRHR（90.4±26.3）、GnIHR（0.55±0.15）mRNA與N組相比P值分別為0.29，0.319; M2組相應(yīng)參數(shù)與M1組比較P值分別為0.010、0.146。
　　③子宮、卵巢GPR54 mRNA水平:M1組子宮GnRHR mRNA（1.24±0.69）、卵巢GnRHRmRNA(2.33±0.98)與N組子宮GnRHR mRNA(0.62±

19、0.32)、卵巢GnRHRmRNA(1.51±2.44)相比對應(yīng)P值分別為0.353，0.523; M2組子宮GnRHR mRNA（0.24±0.07）、卵巢GnRHR mRNA(0.23±0.07)與N組相比對應(yīng)P值分別為0.543，0.309; M2組對應(yīng)參數(shù)與M1組比較P值分別為0.149、0.046。
　　雄性:
　　①下丘腦GnRH、GnIH以及Mel1c mRNA表達(dá):M1組下丘腦GnRH mRNA（0.37±0

20、.13）、GnIH mRNA（8.95±3.02）、Mel1c mRNA（0.19±0.09）與N組下丘腦GnRH mRNA(0.42±0.17)、GnIH mRNA(0.70±0.15)、Mel1c mRNA(0.99±0.56)比較對應(yīng)P值為0.73、0.019、0.005; M2組下丘腦GnRH mRNA（0.11±0.02）、GnIH mRNA（1.15±0.18）、Mel1c mRNA（0.19±0.07）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P

21、值分別為0.132，0.948，0.018; M3組下丘腦GnRH mRNA（0.19±0.04）、GnIH mRNA（7.99±2.06）、Mel1c mRNA（0.13±0.04）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.071，0.038，0.068;M2組與M1組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.027、0.022、0.99;M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.416、0.044、0.70;
　?、诖贵wGPR54、GPR147 mRNA

22、表達(dá):M1組垂體GnRHR mRNA(140.57±21.47)、GnIHR mRNA（0.63±0.11）與N組垂體GnRHR mRNA（254.46±52.78）、GnIHRmRNA（8.83±3.09）比較對應(yīng)P值為0.052、0.004;M2組垂體GnRHR mRNA（191.17±28.68）、GnIHR mRNA（0.81±0.26）與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.285,0.005;M3組垂體GnRHR mRNA(193.

23、29±41.21)、GnIHR mRNA(1.18±0.64)與N組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.274，0.005; M2組與M1組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.39、0.941; M3組與M2組相應(yīng)參數(shù)比較P值分別為0.971、0.876。
　　結(jié)論:
　　一、光照改變可使金黃地鼠出現(xiàn)陰虛火旺表現(xiàn)
　　通過延長光照時(shí)間金黃地鼠出現(xiàn)明顯的躁動(dòng)不安、易激惹狀態(tài)，皮毛光澤度差，進(jìn)食量、飲水量減少，體重下降，這些現(xiàn)象提示延長光照的

24、金黃地鼠存在陰虛火旺證。
　　二、光照改變對外周性器官有一定的影響
　　1)雌性金黃地鼠光照時(shí)間延長，光照強(qiáng)度增加，子宮內(nèi)膜上皮厚度和最大卵泡直徑顯著增加，而子宮肌層呈現(xiàn)下降趨勢。
　　同一光照強(qiáng)度，延長光照時(shí)間雖然子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)、子宮內(nèi)膜上皮、子宮內(nèi)膜、子宮肌層，但無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但卵泡直徑顯著增加;16小時(shí)光照時(shí)間，增加光照強(qiáng)度呈現(xiàn)抑制作用，表現(xiàn)為子宮、卵巢濕重、子宮指數(shù)以及子宮內(nèi)膜上皮、子宮內(nèi)膜、子宮肌層呈

25、下降趨勢。
　　2)雄性金黃地鼠，延長光照強(qiáng)度、光照時(shí)間，光照組睪丸濕重及其指數(shù)顯著上升，且光照時(shí)間延長、光照強(qiáng)度延長不會造成睪丸病理性損傷。
　　三、光照改變對性發(fā)育相關(guān)激素有一定的影響
　　延長光照時(shí)間或增加光照強(qiáng)度，雌性金黃地鼠E2含量下降，而雄性金黃地鼠T含量顯著上升，二者FSH、LH變化不大，光照條件對性發(fā)育相關(guān)激素、外周性腺的影響不同步。
　　四、光照改變能影響金黃地鼠下丘腦-垂體-性腺軸相關(guān)神經(jīng)肽及

26、其受體基因的表達(dá)
　　1)對于雌性金黃地鼠，延長光照時(shí)間或增加光照強(qiáng)度，下丘腦Mel1c基因顯著下降，GnIH mRNA顯著上升，而下丘腦GnRH mRNA有一定的下降趨勢;垂體GPR54，GPR147 mRNA有下降趨勢，考慮延長光照時(shí)間或增加光照強(qiáng)度對性腺軸有抑制作用。
　　2)對于雄性金黃地鼠，延長光照時(shí)間、增加光照強(qiáng)度對性腺軸同樣起抑制作用，表現(xiàn)為下丘腦GnIH mRNA顯著上升，垂體GPR147mRNA顯著下降以及