Ghrelin對大鼠下丘腦-垂體-性腺的影響及其機理研究.pdf

1、目的：探討Ghrelin、GHS-Rla在下丘腦－垂體－性腺上的定位以及Ghrelin mRNA在其上的表達。分析Ghrelin mRNA和GHS-RlamRNA在不同發(fā)情周期大鼠下丘腦－垂體－卵巢上的表達豐度。研究外源性Ghrelin對促性腺激素、性腺激素的分泌及其基因表達的影響。從而揭示Ghrelin對大鼠生殖軸的作用途徑和機理。
　　 方法：(1)分離成年SD大鼠的下丘腦、垂體、卵巢和睪丸，經(jīng)4％多聚甲醛固定，制成石蠟切片

2、，采用免疫組織化學方法觀察Ghrelin及其受體GHS-R]a在上述組織中的定位。(2)使用地高辛標記的Ghrelin寡核苷酸探針，采用原位雜交方法觀察Ghrelin mRNA在下丘腦、垂體、卵巢和睪丸中的表達。(3)實時熒光定量PCR法分析Ghrelin mRNA和GHS-Rla mRNA在不同發(fā)情周期大鼠下丘腦、垂體、卵巢上的表達豐度。(4)采用1％的戊巴比妥鈉1mL對大鼠進行腹腔注射，麻醉后固定于大鼠腦立體定位儀，采用不同劑量的G

3、hrelin（0.3nmol、1nmol、3nmol和生理鹽水對照組）對雄性大鼠和不同發(fā)情周期大鼠進行側(cè)腦室注射，15min后斷頭采血，酶聯(lián)免疫分析法測血清促黃體素、促卵泡素濃度，放射免疫分析法測血清睪酮、雌激素和孕酮的濃度。(5)分離試驗四大鼠的下丘腦、垂體、卵巢和睪丸，實時熒光定量PCR法分析FSH、LH、GnRH、AR、ERβ和PRA+B mRNA表達豐度。(6)成年雄性大鼠和25 d的雌性大鼠斷頭處死，收集睪丸間質(zhì)細胞、黃體細胞

4、和顆粒細胞于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6h，收集培養(yǎng)液和細胞，采用酶聯(lián)免疫、放射免疫分析法測培養(yǎng)液中睪酮、雌激素和孕酮的濃度，實時熒光定量PCR法分析AR、ERβ和PRA+BmRNA的表達豐度。
　　 結(jié)果：(1)Ghrelin與其受體GHS-Rla在下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、正中隆起，腺垂體，睪丸間質(zhì)細胞、精母細胞、睪丸支持細胞，卵母細胞等中均有分布。(2)在下丘腦、垂體、睪丸中，Ghrelin mRNA顯示和Ghrelin一致的分布方

5、式，在卵巢中，顯示出差異性表達。(3)Ghrelin和GHS-Rla在不同發(fā)情周期大鼠的下丘腦、垂體中均有表達，且其表達豐度隨發(fā)情周期的變化而變化。在卵巢中僅發(fā)現(xiàn)Ghrelin mRNA表達，在整個發(fā)情周期均未檢測到GHS-Rla mRNA表達。(4)側(cè)腦室注射Ghrelin能抑制促性腺激素、性腺激素的分泌，其作用效果與所處發(fā)情周期、注射的劑量、性別有關。(5)側(cè)腦室注射Ghrelin顯著抑制GnRH mRNA、FSH mRNA、LH

6、mRNA、ERβmRNA、PRA+B mRNA、AR mRNA的表達，其抑制效果與注射劑量與所處發(fā)情周期有關。(6)在體外，Ghrelin顯著抑制孕酮、雌激素的分泌和ERβ mRNA、PRA+B mRNA的表達。但對睪酮的分泌、AR mRNA的表達不起作用。
　　 結(jié)論：Ghrelin、GHS-Rla和Ghrelin mRNA在大鼠下丘腦、垂體和性腺上均有分布，Ghrelin通過與其受體相互作用，在中樞和外周水平上抑制大鼠促性腺