高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖對雄性SD大鼠下丘腦-垂體-睪丸性腺軸影響及機制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　一、生物信息學(xué)方法研究高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖對雄性SD大鼠新陳代謝的影響
　　目的:應(yīng)用生物信息學(xué)方法探尋高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖雄性SD大鼠生理代謝改變，及肥胖對下丘腦-垂體-睪丸性腺軸可能造成的影響和途徑。
　　方法:利用NCBI中的GEO基因芯片公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)搜索，搜索關(guān)鍵詞為大鼠(rat)，肥胖(obesity)，脂肪組織(adipose tissue)，最終選擇芯片數(shù)據(jù)(G

2、SE8700)作為分析對象。使用bioconductor包中R工具的函數(shù)及Limma程序包識別差異性表達(dá)基因(Differentlyexpressedgenes，DEGs)，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析，選用String在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)果:通過對GSE8700進(jìn)行分析，得到1014個表達(dá)差異基因，其中上調(diào)基因544個，下調(diào)基因470個。上調(diào)差異基因GO條目全部

3、富集于生物過程(BP)，主要為氧化還原、軸突生成、對肽類激素反應(yīng)、對糖皮質(zhì)激素反應(yīng)過程。下調(diào)差異基因GO富集于生物過程(BP)，主要為女性懷孕、對有機物質(zhì)的反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、對類固醇激素的反應(yīng)、甘油三酯代謝等過程;富集于細(xì)胞組成(CC)，主要為細(xì)胞外間質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)，血液微球等組成;富集于分子功能(MF)，主要為絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶活性、脂肪酸結(jié)合、磷脂質(zhì)結(jié)合等功能。上調(diào)差異基因并未富集到任何KEGG通路，而下調(diào)差異基因富集到3條通路，分別為P

4、PAR信號通路（過氧化物酶體增殖物激活型受體）、脂肪的消化和吸收通路、胰腺分泌通路。重要的節(jié)點基因為熱休克蛋白90AB1(Hsp90ab1)，細(xì)胞外鈣敏感受體(Casr)，趨化因子9(Ccl9)，受體相互作用蛋白激酶4(Ripk4)，二甲基甘氨酸脫氫酶(Dmgdh)，脂肪酸結(jié)合蛋白1(Fabp1)，景天庚酮糖激酶(Shpk)，載脂蛋白H(Apoh)，膽囊收縮素受體(Cckar)，谷氨酸代謝受體3(Grm3)等。
　　結(jié)論:高脂飲食

5、誘導(dǎo)性肥胖狀態(tài)下，機體營養(yǎng)物質(zhì)的新陳代謝發(fā)生了改變，尤其是脂質(zhì)代謝發(fā)生了紊亂，這是肥胖的重要特點之一。GO和KEGG結(jié)果提示肥胖狀態(tài)下機體生殖功能可能受到影響，類固醇激素、肽類激素代謝異?？赡苁瞧溆绊懲緩健?br>　　二、高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖對雄性SD大鼠的神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌代謝及生精功能的影響
　　目的:研究肥胖對機體神經(jīng)-生殖內(nèi)分泌代謝和生精功能的影響，并探討上述影響產(chǎn)生的機制。
　　方法:6周齡SPF級雄性SD大鼠45只，

6、隨機分為普通對照組15只、高脂飲食組30只，分別給予普通飼料、高脂飼料喂養(yǎng)16周，最后得到對照組大鼠15只、肥胖組大鼠22只。麻醉后處死，測定大鼠體重、身長、內(nèi)臟脂肪、雙側(cè)腎臟、雙側(cè)睪丸的重量，并計算Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)、腎臟系數(shù)、睪丸系數(shù)。腹主動脈取血，使用放射免疫法測定:Leptin、GLU、LH、FSH、T、E2，使用酶聯(lián)免疫法測定:GnRH、GnIH、SHBG、TC、TG，并根據(jù)相關(guān)公式計算GnRH/GnIH、E2/T、cFT、

7、FTI。將大鼠左側(cè)睪丸固定制作石蠟切片，HE染色觀察生精小管組織學(xué)改變并記Johnsen評分，Tunel法測定睪丸組織生精細(xì)胞凋亡率。將大鼠右側(cè)睪丸于冰上勻漿，測定睪丸組織的SOD活力及MDA含量。制作附睪尾部精子懸液，使用漢密爾頓計數(shù)儀測定精子數(shù)、活力、前向運動精子百分比。
　　結(jié)果:在22周末，高脂飲食肥胖組大鼠(N=22)較對照組大鼠(N=15)體重明顯升高[(552.93±7.76)g vs(622.91±7.26)g]，

8、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01）。與對照組比較，肥胖組大鼠Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)、血清Leptin、INS、TG明顯增高(P＜0.05），而腎臟系數(shù)、睪丸系數(shù)明顯降低(P＜0.05）。與對照組比較，肥胖組大鼠GnRH、GnRH/GnIH比值、LH、TT、SHBG、FTI、cFT明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，E2、 E2/T比值明顯升高(P＜0.05）。與對照組比較，肥胖組大鼠睪丸組織HE染色顯示睪丸生精小管未見明顯萎縮，但生

9、精小管常見“空泡樣”改變，且生精細(xì)胞排列偶見紊亂、層次減少，其睪丸組織Jhosen評分較對照組未見明顯降低(P＞0.05)。與對照組相比，肥胖組大鼠睪丸生精細(xì)胞TUNEL法顯示凋亡增加，凋亡指數(shù)計數(shù)[(3.09±0.28) vs(4.26±0.35)％]降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。與對照組比較，肥胖組大鼠睪丸組織勻漿液SOD活力[(62.57±4.64) vs(47.20±3.05)U/mgprot]降低，MDA濃度[(2.

10、94±0.443) vs(4.18±0.38)nmol/mgprot]升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與對照組比較，肥胖組大鼠附睪精子數(shù)目[(30.07±2.72)×106/ml vs(24.64±1.53)×106/ml]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）;精子活力[(36.40±9.17)％ vs(14.36±7.67)％]，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）;前向運動精子百分比明顯下降[(12.80±3.05)％ vs(

11、5.27±3.14)％]，差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠出現(xiàn)了體重增加、脂肪堆積、瘦素抵抗、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂等代謝改變。高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖SD雄性大鼠下丘腦-垂體-睪丸軸代謝活動發(fā)揮了抑制作用，表現(xiàn)為血清GnRH、LH、T、cFT、SHBG明顯降低，而E2明顯升高。高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可能對睪丸組織以功能性損害為主，短時間內(nèi)對生精小管組織形態(tài)的器質(zhì)性改變較小，但長期來看可能會對其生精

12、小管組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上造成損害。高脂飲食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖大鼠睪丸組織生精細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，并氧化應(yīng)激水平提高，最終導(dǎo)致精子活力下降。
　　三、高脂飲食誘導(dǎo)性肥胖導(dǎo)致雄性SD大鼠的下丘腦Kisspeptin-GnRH系統(tǒng)代謝下調(diào)
　　目的:研究肥胖對下丘腦生殖調(diào)控中樞的影響及可能調(diào)控機制。
　　方法:通過高脂飲食誘導(dǎo)建立肥胖大鼠模型，將對照組(N=18)和肥胖組(N=18)大鼠麻醉后，進(jìn)行下丘腦取材。采用免疫組化染色法測定下

13、丘腦中LepR、Kisspeptin、Kiss1R、GnRH和GnIH的定位和表達(dá)變化;Western-Blot法檢測LepR、Kisspeptin、Kiss1R、GnRH、GnIH的蛋白表達(dá)變化;Real-timePCR法檢測LepR、Kiss1、Kiss1R、GnRH、GnIH的mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示，對照組和肥胖組大鼠的下丘腦LepR陽性著色見于細(xì)胞核的棕黃色著色，而Kisspeptin、Kiss1R

14、、GnRH和GnIH其陽性信號均見于細(xì)胞質(zhì)的棕黃色著色。相比較對照組，肥胖組大鼠其下丘腦弓狀核LepR、Kisspeptin和GnRH表達(dá)顯著減少，但兩組Kiss1R和GnIH表達(dá)均無顯著變化。Western-Blot結(jié)果顯示，較對照相比，LepR、Kisspeptin、Kiss1R、GnRH、GnIH在下丘腦均有陽性條帶表達(dá)?；叶戎捣治鼋Y(jié)果顯示，肥胖組大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH蛋白表達(dá)明顯下降，較對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意

15、義(P＜0.05），而Kiss1R、GnIH表達(dá)未見明顯差異(P＞0.05）。qRT-PCR的結(jié)果顯示，肥胖組大鼠LepR、Kisspeptin、GnRH的mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05），而Kiss1R、GnIH的mRNA表達(dá)未見明顯差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論:高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致大鼠下丘腦LepR明顯降低、瘦素抵抗，最終導(dǎo)致Kisspeptin-GnRH分泌下調(diào)。肥胖對下丘腦-垂體-睪丸性腺軸產(chǎn)生