兔類ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)及定向分化的研究.pdf

1、本研究采用兔胚胎作為試驗(yàn)對象，從中分離克隆出兔類ES細(xì)胞，而且系統(tǒng)地比較了不同的培養(yǎng)條件對兔類ES細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響，并對其進(jìn)行了傳代培養(yǎng)及鑒定;采用不同濃度的視黃酸(retinoic acid，RA)對分離到的兔類ES細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)誘導(dǎo)分化效果進(jìn)行了初步探討，為兔胚胎干細(xì)胞的建系及向原始生殖細(xì)胞的體外分化研究奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)主要結(jié)果如下:
　　1.探討超數(shù)排卵對兔胚胎體

2、外發(fā)育能力的影響，收集自然發(fā)情和超數(shù)排卵處理配種后4d的胚胎，接種于MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，以自然發(fā)情交配所得兔囊胚作為對照。結(jié)果如下:超數(shù)排卵組的胚胎貼壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然發(fā)情組，但沒有顯著差異(P＞0.05)，兔超數(shù)排卵對兔胚胎的體外發(fā)育能力沒有顯著影響。但在干細(xì)胞克隆傳代方面差異顯著(P＜0.05)。因此，為保證試驗(yàn)的效率，尤其在嚴(yán)寒和酷熱的環(huán)境下，兔子自然交配不易成功，對母兔采取超排方式可獲得足夠的胚胎，但在春秋

3、季節(jié)時(shí)獲得胚胎以自然發(fā)情交配為好，其胚胎更適宜分離胚胎干細(xì)胞。
　　2.探討兔胚胎的不同處理對兔胚胎克隆、傳代的影響。將自然發(fā)情獲得的挑破透明帶胚、離散胚和未處理胚分別置MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。結(jié)果顯示:挑破透明帶法和胚胎分割法較對照組得到的胚胎更容易貼壁和增殖，有顯著差異(P＜0.05)，雖然離散胚組的胚胎貼壁率(85.7％)顯著高于挑破透明帶組(70.0％)（P＜0.05），但挑破透明帶組的ICM形成率(53.3％)高于離散胚組(

4、40.0％)(P＜0.05)，挑破透明帶組F1、F2代兔類ES細(xì)胞的克隆率分別為34.7％和25.7％，均顯著高于其他兩組（P＜0.05），最高傳至30代。因此，挑破透明帶有利于提高從兔胚胎中分離胚胎干細(xì)胞的效率，能更好的支持兔類ES細(xì)胞的培養(yǎng)與增殖。
　　3.探討不同培養(yǎng)基對兔胚胎克隆和傳代的影響。結(jié)果顯示:胚胎在含15％ FBS的培養(yǎng)液中ICM集落形成率以及1～5代類ES細(xì)胞傳代過程中均顯著高于其他兩組含15％ KSR和7.5

5、％FBS+7.5％ KSR的培養(yǎng)液(P＜0.05)，培養(yǎng)液為高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇+1％NEAA+15％FBS+100 IU/mL雙抗時(shí)改善了兔類ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)環(huán)境，有利于兔類ES細(xì)胞集落的形成，能夠進(jìn)行穩(wěn)定的傳代。
　　4.探討了機(jī)械消化傳代、胰酶消化傳代和“機(jī)械+胰酶”消化傳代3種不同的傳代方法對兔類ES細(xì)胞分離培養(yǎng)傳代的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“機(jī)械+胰酶”消化傳代法最有利于

6、兔類ES細(xì)胞傳代和集落的形成，細(xì)胞克隆形態(tài)最佳，為理想的ES細(xì)胞分離傳代方法。
　　5.將分離克隆得到的兔類ES細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，堿性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫熒光鑒定兔類ES細(xì)胞集落均呈陽性;提取兔類ES細(xì)胞集落的RNA，擴(kuò)增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH經(jīng)RT-PCR檢測，得到了與預(yù)期大小一致的目的片段。體外分化形成具有三個(gè)胚層構(gòu)成的類胚體(embryoid bodies，EBs)。
　　6

7、.探討不同濃度的RA對兔類ES細(xì)胞向原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化的能力。采用不同濃度RA(0.2μM、2μM、20μM)誘導(dǎo)液和不加RA的培養(yǎng)液對兔類ES細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA倍體分析，結(jié)果顯示:0.2μM濃度RA誘導(dǎo)21 d經(jīng)DNA倍體分析單倍體含量達(dá)54.4％，誘導(dǎo)效率最高，2μM濃度RA誘導(dǎo)14d經(jīng)DNA倍體分析單倍體含量達(dá)12.6％，而其他濃度在誘導(dǎo)了相同天數(shù)則不含單倍體，說明兔類ES細(xì)胞可以用RA向原始生殖細(xì)胞誘導(dǎo)，0.