致病細(xì)菌三型分泌系統(tǒng)(T3SS)高度保守的ATPase結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、細(xì)菌編碼的三型分泌系統(tǒng)(T3SS)通常是致病性和毒力的根源。適當(dāng)?shù)沫h(huán)境因素可激活T3SS編碼基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)了結(jié)合在雙層細(xì)胞膜上的巨大針狀復(fù)合物的組裝以及各種效應(yīng)蛋白的運(yùn)輸。T3SS分泌的效應(yīng)蛋白包括大量的毒力因子。這些毒力因子可通過(guò)針狀復(fù)合物直接輸送至宿主細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮裂解細(xì)胞，干擾細(xì)胞功能等作用，最終產(chǎn)生致病。因此，T3SS被認(rèn)為是抗毒力類(lèi)抗感染藥物設(shè)計(jì)的理想靶標(biāo)。
　　T3SS組裝的針狀復(fù)合物的核心元件之一是高度保守的

2、ATPase，T3SS ATPase組裝成環(huán)狀同源六聚體，位于針狀復(fù)合物的基底。其功能包括效應(yīng)蛋白的識(shí)別，并利用ATP水解的能量將效應(yīng)蛋白運(yùn)輸至針狀復(fù)合物的中央隧道，實(shí)現(xiàn)向胞外的分泌。以往的研究表明，T3SS ATPase具有和F-type或V-type ATP合成酶高度同源的空間結(jié)構(gòu)，因此暗示了T3SS ATPase使用與F-type或V-type ATP合成酶相似的機(jī)制驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)底物的輸送。為證明這一假說(shuō)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究揭示了T3S

3、S ATPase單體具有和ATP合成酶異源六聚體中β亞基相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，然而由于T3SS ATPase高度的不穩(wěn)定性，六聚體的結(jié)構(gòu)始終缺乏高分辨率結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)支持。T3SS ATPase六聚體組裝的唯一實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自HrcN蛋白的電鏡研究。然而基于分辨率的局限，電鏡結(jié)構(gòu)無(wú)法提供六聚體組裝，NTP結(jié)合及底物運(yùn)輸?shù)冉Y(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。
　　為揭示三型分泌系統(tǒng)ATPase底物結(jié)合的特異性以及其參與效應(yīng)蛋白輸出的分子機(jī)制，本課題結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物物理及

4、生物化學(xué)和細(xì)菌學(xué)等多學(xué)科手段對(duì)痢疾桿菌T3SS ATPase Spa47及沙門(mén)氏菌T3SS ATPase InvC進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。首先，通過(guò)等溫滴定的方法(ITC)測(cè)量了Spa47及InvC特異性結(jié)合不同核苷酸ATP，AMPPNP，ATPγS和ADP的能力。發(fā)現(xiàn)ATPγS的結(jié)合活性最接近天然底物ATP的結(jié)合活性，然而廣泛使用的ATP類(lèi)似物AMPPNP的結(jié)合能力僅與產(chǎn)物ADP的結(jié)合能力相當(dāng)。為了進(jìn)一步揭示T3SS ATPase的底物識(shí)別

5、特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們分別解析了缺失N-端膜結(jié)合區(qū)和β-barrel結(jié)構(gòu)域的Spa47和InvC的晶體結(jié)構(gòu)及其與各種不同核苷酸形成的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，分別為Spa47Δ1-83-ATPγS，Spa47Δ1-83-AMP-PNP, Spa47Δ1-83-ADP和 InvCΔ1-83-ATPγS,InvCΔ1-83-AMP-PNP，InvCΔ1-83-ADP。晶體結(jié)構(gòu)分析揭示Spa47和InvC由典型的α/β Rossmann fold和C端

6、螺旋束(helical bundle)結(jié)構(gòu)域組成，與其他T3SS ATPase結(jié)構(gòu)相似，驗(yàn)證了這類(lèi)ATPase在結(jié)構(gòu)上的保守性和酶學(xué)活性機(jī)制的相似性。在T3SSATPase與核苷酸結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，僅有ATPγS和輔酶鎂離子與Spa47或InvC的活性中心完全結(jié)合，因而揭示了T3SS ATPase識(shí)別ATP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Apo T3SSATPase與各種核苷酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的比對(duì)分析確定識(shí)別ATP關(guān)鍵分子間作用力為P-loop與連接β和

7、γ磷酸集團(tuán)之間氧原子的氫鍵。由于在AMPPNP中β和丫磷酸集團(tuán)之間氧原子被氮原子取代，不支持氫鍵的形成，這些發(fā)現(xiàn)解釋了AMPPNP的結(jié)合能力與缺失γ磷酸集團(tuán)的ADP類(lèi)似。通過(guò)對(duì)Spa47和InvC結(jié)合ATPγS復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的深入分析，我們進(jìn)而發(fā)現(xiàn)核苷酸的結(jié)合引起了一系列位于活性中心的構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化繼而傳導(dǎo)至下游的β9-α8 loop。β9-α8 loop位于T3SS ATPase六聚體中央隧道內(nèi)部，直接參與了效應(yīng)蛋白的運(yùn)輸。<

8、br>　　綜上所述，本研究首次解析了T3SSATPase與核苷酸和催化鎂離子復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，提供了識(shí)別ATP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。我們的結(jié)果確定了T3SS ATPase識(shí)別核苷酸的關(guān)鍵位點(diǎn)，為核苷酸類(lèi)抑制劑設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)了ATP結(jié)合引起的構(gòu)象變化可導(dǎo)致參與效應(yīng)蛋白輸送的β9-α8 loop的構(gòu)象變化，從而暗示了ATP水解活性與效應(yīng)蛋白輸送之間的關(guān)聯(lián)，為了解T3SSATPase功能機(jī)理提供了線索。三型分泌系統(tǒng)是細(xì)菌毒力研究的核心科學(xué)問(wèn)