不同月齡胎兒臍帶和不同培養(yǎng)方法對分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種新的種子細(xì)胞來源越來越受到人們的重視。先前的研究表明從人臍帶組織中分離的間充質(zhì)干細(xì)胞既具有增殖能力，又具有向多細(xì)胞(神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞等)分化的能力<'[1、2]>，加之來源廣泛、取材容易，在細(xì)胞移植、基因治療、組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。然而，我們在過去四年的研究中體會到從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞并非易事，特別是如何快速、高效的從臍帶中獲得MSC以滿足基礎(chǔ)和未來臨床研

2、究的需要是一個亟待解決的問題。為此，本課題對不同胎齡胎兒臍帶和不同培養(yǎng)方法對分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響進(jìn)行了研究。 方法： 1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：(1)組織貼塊法：分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶35例及流產(chǎn)胎兒臍帶33例，以PBS充分沖洗，剔除臍帶動、靜脈，將其余的臍帶間質(zhì)組織切割成直徑約1mm大小的組織塊，在含有20％的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100<'U>/ml青霉素，10μg/ml鏈

3、霉素的低糖型培養(yǎng)基(HG-DMEM)中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)3-7天后，顯微鏡下可見大量細(xì)胞自組織塊中游出，向外呈放射狀貼壁生長。待細(xì)胞達(dá)到80％-90％匯合后，加入0.2％胰酶消化傳代。收集MSCs臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后凍存待用。(2)膠原酶．胰酶消化法：分別取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶17例及流產(chǎn)胎兒臍帶15例，超凈臺內(nèi)取出臍帶PBS充分洗滌，沖去臍靜脈及動脈內(nèi)的殘存血，將臍帶剪碎至1 mm3大小組織塊，移至0.1％膠原酶Ⅳ中，37℃持續(xù)攪拌

4、消化30 min；隨即向膠原酶一組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為0.1％的胰酶在37℃環(huán)境中繼續(xù)攪拌消化30 min；10％FBS終止消化，用細(xì)胞篩過濾，將含細(xì)胞的濾液進(jìn)行離心。細(xì)胞接種于LG-DMEM培養(yǎng)基的T-25塑料培養(yǎng)瓶中。3，4 d后，更換培養(yǎng)基，去掉未貼壁細(xì)胞。以后每3天換液1次，至細(xì)胞融合傳代。 2 將貼壁的干細(xì)胞消化。加入0.2％胰酶/0.2％EDTA，待細(xì)胞大部分變成圓形后，加入含有10％FBS的DMEM中止消化

5、，吹打貼壁細(xì)胞使貼壁細(xì)胞變成懸浮狀態(tài)。1000rpm離心10分鐘，棄上清液，PBS洗滌(去除剩余的血清等)。室溫下，1000rpm離心10分鐘，臺盼藍(lán)染色法評估細(xì)胞活性，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。安每管3-4×10 5分成12管各管中加入下述PE、FITC、PERCP、及APC標(biāo)記的小鼠抗人單克隆抗體5ul，充分混勻，4℃避光孵育30分鐘。1800rpm離心5分鐘，去除上清液，加入2MLBS 1000rpm離心兩次，各5分鐘。調(diào)整最終容積為200

6、ML，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。同時以小鼠FITC、PE、APC、PERCP標(biāo)記的IgG1作為同型對照。所用抗體包括：PE-CDl3、FITC-CDl4、APC-CD29、FITC-CD31、FITC-CD34、PE-CD38、PE-CD44，PERCP-CD45， APC-CD90、FITC-CD105、PE-CD133、PE-CD166、HLA-DR。 結(jié)果： 1.組織塊原代培養(yǎng)：足月齡臍帶組約1周左右，可見細(xì)胞自組織

7、塊游出，貼壁呈放射狀生長，形態(tài)較均一，呈長梭形。經(jīng)10天左右達(dá)到80％-90％匯合，鏡下可見細(xì)胞胞漿豐富，軸突伸長，多角狀。消化后以1：2-1：3的比例傳代細(xì)胞，接種約30分鐘后細(xì)胞開始貼壁，6-8小時貼壁完全，傳代后經(jīng)換液3-5天完全匯合時鏡下可見細(xì)胞排列緊密，無序生長，小月齡臍帶組約4-5天左右可見細(xì)胞游出,經(jīng)5天左右達(dá)到80％-90％匯合，細(xì)胞傳代增殖特點與足月組相似。第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞，散在分布。 2.

8、膠原酶．胰酶消化法：第2天即看見有少量形態(tài)各異的貼壁細(xì)胞，散在分布長梭形細(xì)胞間可見少量鵝卵石樣細(xì)胞組成的集落，考慮為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。長梭形細(xì)胞即為MSC細(xì)胞，其形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，增殖能力旺盛，約1周左右時，貼壁細(xì)胞形成集落，占優(yōu)勢的是成纖維樣細(xì)胞，此外還有臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，至2周左右可達(dá)到80％融合，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長則受到明顯抑制。2.5g/L胰酶消化，傳代后可得到較純化的成纖維樣細(xì)胞。 3.流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示：對小月齡

9、胎兒臍帶培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析表明：CD13、CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達(dá)，本實驗結(jié)果表明，UCMSCs表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志。這和足月胎兒臍帶流式檢測結(jié)果一致。并與骨髓、臍血、胎肺等其他組織來源的MSCs流式檢測結(jié)果也一致。對CD13、CD29、CD44、CD90的表達(dá)達(dá)97％以上說明細(xì)胞成分比較均一。 4.統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示：UC-MSC的原代培

10、養(yǎng)中小月齡胎兒組細(xì)胞爬出、首次達(dá)80％融合時間、細(xì)胞總數(shù)達(dá)到106的時間及培養(yǎng)成功率均明顯早于足月胎兒組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，傳代以后的細(xì)胞增值時間相近，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。組織貼塊組成功率明顯高于酶源消化法，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 本實驗中小月齡胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC在原代培養(yǎng)中周期明顯較足月胎兒臍帶培養(yǎng)的MSC短，應(yīng)用組織貼塊法培養(yǎng)成功率高于酶原消化法，可在更短時間內(nèi)獲的所需細(xì)胞