龜甲中促皮膚和骨修復(fù)愈合作用成分分析研究.pdf

1、目的： 分析動(dòng)物藥龜甲中的微量元素與常量元素、膠原蛋白和脂肪酸成分，以確定龜甲中促進(jìn)皮膚和骨修復(fù)愈合作用的藥效成分的組成和含量，為龜甲皮膚和骨修復(fù)愈合作用機(jī)制及藥效學(xué)研究明確藥效物質(zhì)。 方法： 實(shí)驗(yàn)一采用濕法HNO3-HClO4消解法消解，利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，測定龜甲中Na、K、Ca、Mg等常量元素，以及P、Sr、Ba、Mn、Fe、Cu、Zn等微量元素，并對龜甲中Ca的形態(tài)組成進(jìn)

2、行分析。 實(shí)驗(yàn)二基于羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性氨基酸，直接將龜甲中膠原蛋白酸水解為含羥脯氨酸的氨基酸水提液，經(jīng)異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生化后，以A：0.1mol/L醋酸鈉溶液-乙腈(94:6)(pH6.5)、B：乙腈-水(80:20)為二元流動(dòng)相，經(jīng)C18色譜柱分離，UV-VIS檢測器于254nm處測定羥脯氨酸含量，再計(jì)算出龜甲中膠原蛋白的含量。 實(shí)驗(yàn)三利用正己烷/異丙醇組成的低毒試劑(HIP溶劑法)，提取龜甲中的

3、脂質(zhì)成分，再通過皂化、萃取及ω-溴代苯乙酮衍生化，輔以催化試劑三乙醇胺，以甲醇:乙腈:水(325:135:50)為流動(dòng)相，經(jīng)C18色譜柱分離，UV-VIS檢測器于242nm處檢測十四酸、亞油酸、十六酸、油酸、十八酸等5種脂肪酸成分。 結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)一同時(shí)測定了Na、K、Ca、Mg、P、Sr、Ba、Mn、Fe、Cu、Zn等11種常量元素和微量元素，精密度RSD最低為Na元素0.46％，最高為Cu元素4.01％；所測定的6份供

4、試品中11種常量元素與微量元素的平均回收率，最低為Mg元素90.90％，最高為Na元素109.14％；計(jì)算每種元素在龜甲中的含量分別為：Na7.880mg/g、K0.5071mg/g、Mg2.896mg/g、Sr0.3223mg/g、Ba0.1187mg/g、Mn0.01864mg/g、Fe0.5908mg/g、Cu0.01543mg/g、Zn0.1410mg/g、Ca214.9mg/g、P83.28mg/g，證實(shí)Ca、P最高，這與龜甲

5、呈骨質(zhì)結(jié)構(gòu)以磷酸鈣Ca3(PO4)2形態(tài)存在有關(guān)。此外，由磷酸鈣分子式可知Ca/P分子量之比為2，而本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，龜甲水溶液中Ca/P的含量比約為3，由此可推斷龜甲水溶液液中存在游離態(tài)鈣，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定龜甲中游離態(tài)鈣的平均含量為3.838mg/g。 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法線性范圍為0.02～0.20mg/mL，r=0.9999，平均回收率為102.0％，RSD為2.47％，4個(gè)批次龜甲羥脯氨酸的含量分別為14.13mg·g-1

6、、14.20mg·g-1、14.33mg·g-1、14.39mg·g-1，由于羥脯氨酸在膠原蛋白中的含量約為10％，直接換算得出龜甲中膠原蛋白的含量約為14.25％。 實(shí)驗(yàn)三同時(shí)檢測出5種含量較多的脂肪酸成分，分別為十四酸、十六酸、十八酸、油酸、亞油酸，并建立了這5種脂肪酸的定量檢測方法，十四酸的線性范圍為0.05～0.45μg，r=0.9997，亞油酸的線性范圍為0.10～0.90μg，r=0.9995，十六酸線性范圍為0.1

7、0～0.90μg，r=0.9994，油酸的線性范圍為0.10～0.90μg，r=0.9993，十八酸的線性范圍為0.033～0.30μg，r=0.9996；平均回收率依次為100.27％，98.74％，101.94％，99.36％，97.99％，方法RSD分別為2.92％，3.76％，1.88％，2.55％，1.44％；測定了3批龜甲中的5種脂肪酸，其平均含量分別為0.0597μg/g、0.121μg/g、0.112μg/g、0.116

8、μg/g、0.0472μg/g。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)表明中藥龜甲中所含促皮膚和骨修復(fù)愈合作用的藥效成分組成復(fù)雜多樣。在分析測定這些組分的實(shí)驗(yàn)中，首次使用了目前較為先進(jìn)、快速的ICP-AES法測定龜甲中的常量元素和微量元素，并首次建立了分析龜甲中膠原蛋白的PITC柱前衍生化高效液相色譜方法及龜甲中脂肪酸成分的高效液相色譜方法，準(zhǔn)確地測定了龜甲中膠原蛋白及5種脂肪酸成分的含量。目前對于中藥中動(dòng)物藥的研究遠(yuǎn)不如植物藥廣泛深入，龜甲