胭脂魚α-淀粉酶的cDNA克隆與組織表達研究.pdf

1、α-淀粉酶以隨機作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是廣泛應(yīng)用于葡萄糖生產(chǎn)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā)酵以及紡織等許多行業(yè)中的一種重要的工業(yè)用酶。胭脂魚是我國特有珍稀魚類，為國家二級保護動物，具有個體大、生長快、肉質(zhì)鮮美、性情溫馴、抗病力強等特點。魚類α-淀粉酶是碳水化合物水解酶類的一種，肝胰臟是α-淀粉酶中心生成器官，它分泌機能的強弱直接影響魚類對食物的消化能力。很多的實驗都表明α-

2、淀粉酶的合成過程并不是由攝食所誘導(dǎo)的，而是魚類自身發(fā)育的一種生命現(xiàn)象，其酶的合成與日齡有關(guān)。目前，還沒有從分子水平闡明胭脂魚α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)。本研究對胭脂魚α-淀粉酶mRNA進行了克隆和序列測定分析，并進一步探討了α-淀粉酶在魚體各組織中的表達情況，這使我們可以更清楚地了解魚體是在何部位利用食物中相應(yīng)成分的，也為研究α-淀粉酶的分泌、貯存機制提供了途徑。主要研究結(jié)果如下： 1．胭脂魚α-淀粉酶基因的全長cDNA序列在對多種硬骨魚

3、類的α-淀粉酶基因進行了多重比對后設(shè)計了2對特異性中間片斷引物，以來自胭脂魚肝胰臟的mRNA為模板擴增得到了胭脂魚α-淀粉酶的中間片斷序列。根據(jù)得到的中間片斷序列設(shè)計了兩條用于擴增α-淀粉酶基因的3’端的上游引物，用此兩條上游引物和試劑盒提供的兩條下游引物，擴增得到了胭脂魚α-淀粉酶基因的3’端序列。再根據(jù)得到的中間片段序列和3’端序列設(shè)計了三組5’RACE特異性引物，從而得到了胭脂魚α-淀粉酶的5’端序列。 對所得到的三段序列

4、進行拼接，得到了胭脂魚α-淀粉酶的cDNA序列，它全長1633bp，5’非編碼區(qū)為24bp，編碼區(qū)包括1539個核苷酸。編碼一個長512個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)前體，3’非編碼區(qū)為70bp。 2．胭脂魚α-淀粉酶基因推導(dǎo)氨基酸序列的分析克隆得到的胭脂魚α-淀粉酶的cDNA全長為1633bp，包括一個5'非編碼區(qū)、一個編碼512個氨基酸的開放閱讀框、TAA終止密碼子和一個包括加尾信號和poly(A)尾的3'非編碼區(qū)。編碼區(qū)核苷酸長度為

5、1539bp，編碼512個氨基酸，由信號肽(15個氨基酸)、三個活性位點殘基，三個氯離子結(jié)合位點殘基，四個鈣離子結(jié)合位點殘基和10個半胱氨基酸殘基構(gòu)成。 3.胭脂魚α-淀粉酶基因的同源性分析胭脂魚α-淀粉酶基因的核苷酸序列與許多動物的α-淀粉酶基因具有較強的相似性。在DNAMAN軟件上對不同物種的α-淀粉酶基因cDNA全序列進行序列比對，結(jié)果表明，胭脂魚α一淀粉酶的cDNA序列的編碼區(qū)與斑馬魚(Danio rerio)、尖吻鱸(

6、Lates calcarifer)、美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectes americanus)、大西洋鮭魚(Salmo salar)α-淀粉酶的cDNA序列的編碼區(qū)的一致性為88.50％、78.30％、76.80％、72.51％，全序列的一致性為86.10％、75.26％、75.17％、70.73％。 胭脂魚α-淀粉酶在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性。胭脂魚α-淀粉酶氨基酸與斑馬魚(Danio rerio

7、)、尖吻鱸(Lates calcarifer)、美洲黃蓋鰈(Pseudopleuronectesamericanus)、大西洋鮭魚(Salmo salar)等魚類α-淀粉酶氨基酸之間的相似性很高，分別為89.65％、82.03％、79.88％、74.80％；而與兩棲類的光滑爪蛙(Xenopus laevis)、哺乳類的豬(Sus scrofa)以及人(Homo sapiens)的相似性分別為76.39％、74.33％、71.88％。

8、 4.胭脂魚α-淀粉酶基因推導(dǎo)蛋白的分析及其結(jié)構(gòu)預(yù)測預(yù)測胭脂魚α-淀粉酶基因編碼一個512個氨基酸的多肽鏈，分子量Mw=56910.87Da，等電點pI=8.49。在氨基酸組成上，甘氨酸含量最高，為11.72％；其次是天冬酰氨、纈氨酸、亮氨酸及絲氨酸，分別為8.98％、7.42％、6.45％、6.05％.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，其二級結(jié)構(gòu)主要由四種組成，即α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、隨機卷曲和延伸鏈，隨機卷曲是最主要的二級結(jié)構(gòu)。 5.胭脂