Ihh-PTHrP信號軸在肉雞股骨頭壞死發(fā)生中的作用機理研究.pdf

1、肉雞是選育程度最高的家禽之一。高強度的選育改善了生產(chǎn)性能，集約化的飼養(yǎng)管理方式降低了生產(chǎn)費用，使肉雞的經(jīng)濟價值得到顯著提升的同時也導(dǎo)致肉雞腿病為代表的營養(yǎng)代謝病發(fā)病率居高不下。肉雞腿病是一類疾病的統(tǒng)稱，包括肉雞股骨頭壞死，肉雞脛骨發(fā)育不良等等。肉雞股骨頭壞死的臨床特征表現(xiàn)為跛行，因不能正常飲水和采食，病雞常發(fā)生衰竭和死亡。該病不僅嚴重影響動物福利，導(dǎo)致的經(jīng)濟損失也相當(dāng)可觀。該病病因十分復(fù)雜，至今為完全闡明。根據(jù)大量流行病學(xué)統(tǒng)計分析、試驗

2、研究和臨床觀察，認為肉雞股骨頭壞死的發(fā)生與機體內(nèi)外的諸多因素有關(guān)，其中最重要的是內(nèi)部因素。內(nèi)部因素中軟骨內(nèi)成骨異常是導(dǎo)致肉雞股骨頭壞死的最重要的因素之一。
　　軟骨內(nèi)成骨受多種激素和細胞因子的調(diào)控。這些調(diào)控因子共同作用于生長板軟骨細胞，調(diào)控軟骨細胞的增殖、分化和成熟，影響股骨、脛骨等長骨的縱向生長。在諸多調(diào)控因子中，Ihh/PTHrP信號軸的作用十分關(guān)鍵，該信號通路的紊亂可致肉雞股骨頭壞死，然而該信號軸在肉雞股骨頭壞死病理發(fā)生中的

3、作用機理，尚未見系統(tǒng)報道。本研究目的旨在建立肉雞股骨頭壞死動物模型，比較未發(fā)病肉雞與股骨頭壞死模型，生產(chǎn)性能變化，股骨近端生長板Ihh、PTHrP基因表達和骨代謝指數(shù)、骨生物學(xué)指標變化，結(jié)合體外試驗研究該信號軸對軟骨細胞的分子作用機理，闡明該信號軸在肉雞股骨頭壞死中的作用機制，為該病的病理學(xué)和診斷學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　1、Ihh/PTHrP信號軸在肉雞股骨頭壞死病理發(fā)生中的調(diào)控作用
　　選用1日齡的Ross308白羽肉雞

4、60羽，隨機分為試驗組和對照組，預(yù)飼1周后，處理組連續(xù)肌肉注射甲潑尼龍（20mg/kg體重），對照組注射等量無菌生理鹽水。比較自然發(fā)病肉雞、誘導(dǎo)發(fā)病肉雞和未發(fā)病肉雞的體重、采食量、肝指數(shù)、骨代謝指數(shù)、骨骼生物力學(xué)指標、組織學(xué)病理學(xué)變化。結(jié)果表明:誘導(dǎo)發(fā)病肉雞病理變化與自然發(fā)病肉雞基本相同，表明本試驗采用激素誘導(dǎo)成功建立了肉雞股骨頭壞死動物模型。與未發(fā)病肉雞比較，自然發(fā)病與人工誘導(dǎo)股骨頭壞死肉雞體重、骨長度、骨重、骨強度、骨密度顯著降低;

5、生長板和關(guān)節(jié)軟骨厚度均顯著降低;生長板Ihh、GLI2、BMP6、MMP9、Bcl-2、VEGF、Ⅱ型膠原等基因表達顯著減低，而X型膠原、PTHrP表達量顯著上升。該試驗結(jié)果表明，采用連續(xù)胸肌肌肉注射甲潑尼龍（20mg/kg體重）的建模方法確實，Ihh-PTHrP信號軸紊亂在FHN發(fā)病過程中有重要調(diào)控作用。
　　2、Ihh/PTHrP信號軸對肉雞軟骨細胞增殖、分化、成熟的調(diào)控機理
　　選用用42日齡Ross肉雞，分離培養(yǎng)脛骨

6、近端生長板軟骨細胞原代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)24 h后加入不同濃度Ihh信號阻斷劑環(huán)杷明(10-4～10-7 M)孵育12h、24 h、48 h后，檢測堿性磷酸酶活性，運用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)、Indian hedgehog(Ihh)、Ⅹ型膠原、Ⅱ型膠原表、GLI2、BMP-6、Bcl-2等上下游相關(guān)因子的表達，研究Ihh信號抑制后相關(guān)因子變化情況。結(jié)果顯示，Ihh信號被阻斷后，軟骨細胞PTH