CD147-Sp1關(guān)系環(huán)對卵巢癌細(xì)胞侵襲性影響的研究.pdf

1、卵巢癌（ovarian cancer,OC）是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于宮頸癌與子宮內(nèi)膜癌之后，排名第三[1-3]，其中上皮性腫瘤占原發(fā)性卵巢腫瘤的50％~70%，而惡性類型占卵巢癌的85%~90%[4]。多數(shù)卵巢癌病人由于早期缺乏明顯的臨床癥狀和高效的篩查技術(shù),在發(fā)現(xiàn)時(shí)已為時(shí)已晚，并且期別也很高，也就促成了卵巢癌的治療難度大、復(fù)發(fā)率高，5年生存率非常低的嚴(yán)峻形勢[5]。
　　CD147，又名EMMPRIN或 Ba

2、sigin，是一個(gè)高度糖基化的跨膜蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員[6-9]。CD147通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）分泌降解細(xì)胞外基質(zhì)或通過上調(diào) VEGF表達(dá)、抑制凋亡等多種途徑促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[10-12]。CD147的高表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后息息相關(guān)[13]，作為一種重要的腫瘤標(biāo)志物，闡明其表達(dá)調(diào)控機(jī)制對卵巢癌的診斷及治療具有重要意義。
　　孔等[14]的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Sp1能直接與CD147啟動(dòng)子區(qū)特異結(jié)合并能有效啟動(dòng)

3、其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)CD147的低甲基化可以增加其與Sp1蛋白的親和力，從而上調(diào)CD147表達(dá)。
　　研究報(bào)道提示Sp1蛋白的磷酸化形式對于Sp1介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活作用具有重要意義[15]。Sp1的磷酸化形式或可增加其與DNA的結(jié)合能力，或可增加其蛋白的穩(wěn)定性，或可影響它的轉(zhuǎn)錄活性。Tan等發(fā)現(xiàn)管緊張素Ⅱ激活PKC通路使Sp1的鋅指結(jié)構(gòu)域（Thr668，Ser670和Thr681位點(diǎn)）磷酸化，磷酸化后的Sp1與血小板衍生因

4、子-D啟動(dòng)子的結(jié)合能力增加[16]。阻斷JNK信號通路導(dǎo)致的Sp1在Thr278和Thr739位點(diǎn)的磷酸化，可以導(dǎo)致Sp1的蘇木素化，加速降解[17,18]。由于Sp1的轉(zhuǎn)錄活性受到其與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，蛋白的合成，核酸轉(zhuǎn)運(yùn)能力，與其它蛋白的相互作用以及蛋白的穩(wěn)定性等多種因素影響，很難判斷Sp1的磷酸化對CD147轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　本課題的研究目標(biāo)有四點(diǎn)：首先明確Sp1磷酸化是否參與CD147基因調(diào)控，其次探討其具體調(diào)控機(jī)制[

5、19]，再次分析Sp1磷酸化與CD147基因的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響，最后分別在卵巢癌細(xì)胞及組織中分析Sp1磷酸化與CD147表達(dá)的相關(guān)性[20]。
　　第一部分：明確Sp1磷酸化參與CD147基因表達(dá)調(diào)控。我們運(yùn)用基因定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了6個(gè)Sp1磷酸化位點(diǎn)的突變體（Thr355，Thr453，Th668，Ser670，Thr681，Thr739）[21,22]，將特定位點(diǎn)的絲?蘇氨酸突變成谷氨酸，使其失去被磷酸化激活的功

6、能。之后通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染突變體和CD147啟動(dòng)子檢測螢火蟲熒光素酶強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)Sp1在Thr453和Thr739兩個(gè)位點(diǎn)的突變可以顯著降低Sp1對CD147基因表達(dá)上調(diào)的作用[23]。在隨后的實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。
　　第二部分：探討Sp1磷酸化調(diào)控CD147基因表達(dá)機(jī)制。為了探討Sp1磷酸化參與CD147基因表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制，我們運(yùn)用PI3K/AKT和MAPK/ERK磷酸化通路特定抑制劑LY29

7、4002、雷帕霉素和PD98059預(yù)處理卵巢癌細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)[24]，Sp1在Thr453和Thr739兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平會(huì)隨之下降，而總蛋白未見明顯變化。此外，我們還發(fā)現(xiàn) CD147的蛋白水平也隨之下降，提示通過 PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途徑可以激活Sp1的磷酸化，而當(dāng)Sp1磷酸化水平受抑制時(shí)，CD147的表達(dá)水平也下降，提示Sp1磷酸化對Sp1激活CD147基因轉(zhuǎn)錄具有激活作用。而當(dāng)我們上調(diào)或下調(diào)CD147的表達(dá)后

8、，發(fā)現(xiàn)pAKT，p70S6k和pERK以及Sp1在Thr453和Thr739兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平均下降，而總蛋白均未見明顯變化。綜合第一部分實(shí)驗(yàn)，我們得知Sp1在Thr453和Thr739位點(diǎn)的磷酸化可以增強(qiáng)Sp1對CD147基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，而在SKOV3細(xì)胞中過表達(dá)CD147基因后，Sp1在Thr453和Thr739位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)增加[25]。這是由于上游的PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK通路被活化造成的。CD147

9、-Sp1關(guān)系環(huán)構(gòu)成的正反饋環(huán)路可能成為解釋CD147差異性表達(dá)的原因之一。
　　第三部分：檢測Sp1磷酸化與CD147基因表達(dá)的相互作用對卵巢癌侵襲性的影響。用Sp1（在Thr453和Thr739位點(diǎn)）磷酸化抗體和CD147單抗單獨(dú)或聯(lián)合封閉卵巢癌HO-8910細(xì)胞系的高轉(zhuǎn)移株，Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲性降低，提示Sp1-CD147關(guān)系環(huán)可以增加卵巢癌的侵襲性。
　　第四部分：檢測Sp1磷酸化與CD147基

10、因在卵巢癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)并分析其相關(guān)性。我們運(yùn)用Western blot方法檢測卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、HO-8910和HO-8910PM中p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達(dá)。結(jié)果顯示在卵巢癌細(xì)胞中Sp1磷酸化蛋白水平和CD147蛋白在三種細(xì)胞系中的表達(dá)高低具有一致性。之后我們運(yùn)用免疫組化的方法檢測了53例卵巢癌標(biāo)本中的p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達(dá)和分

11、布。結(jié)果顯示Sp1的磷酸化蛋白主要表達(dá)于卵巢癌的細(xì)胞核膜和核內(nèi)，而CD147主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中。CD147的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果示12例(強(qiáng)陽性，22.64%)；15例(陽性，28.30%)；6例(弱陽性，11.32%)；20例(陰性，37.74%) Phospho-Sp1(T453)的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果示24例(強(qiáng)陽性，45.28%)；13例(陽性，24.53%)；7例(弱陽性，13.21%)；9例(陰性，16.98%)而 phos

12、pho-Sp1(T739)的表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果示16例(強(qiáng)陽性，30.19%)，14例(陽性，26.42%)，10例(弱陽性，18.87%)；13例(陰性，24.53%)。CD147陽性結(jié)果所占比例為62.26%，而 phospho-Sp1(T453)和phospho-Sp1(T739)的陽性表達(dá)率分別為83.02%，75.47%。Spearman秩相關(guān)分析顯示p-Sp1（Thr453）、p-Sp1（Thr739）和CD147的表達(dá)低度相