尾加壓素Ⅱ(Urotensin Ⅱ)及其受體GPR14高表達(dá)與人糖尿病大動脈病變相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　明確尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)和它的特異性受體GPR14的高表達(dá)與人糖尿病大動脈病變的相關(guān)性，比較尾加壓素Ⅱ及其受體GPR14在糖尿病人主動脈平滑肌細(xì)胞與非糖尿病人主動脈平滑肌細(xì)胞中的差異性表達(dá)，探尋糖尿病大動脈病變預(yù)防及治療的新靶點、新途徑。
　　方法：
　　實驗取臨床心外科大血管手術(shù)或冠狀動脈旁路移植手術(shù)中收集的主動脈組織，用組織塊貼壁法培養(yǎng)人主動脈平滑肌原代細(xì)胞，形態(tài)學(xué)和免疫熒光法對血管

2、平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，傳代后選取第3-6代細(xì)胞備用。根據(jù)病人是否有糖尿病將取自標(biāo)本培養(yǎng)的細(xì)胞分為糖尿病組和非糖尿病組，糖尿病組病人糖尿病史1年以上、平素血糖控制欠規(guī)律，術(shù)前平均血糖在11.1 mmol/L以上，非糖尿病組病人術(shù)前平均血糖在正常范圍(3.9-6.1mmol/L)。根據(jù)不同處理，糖尿病組和非糖尿病組再分別分為UⅡ組、UT拮抗組、對照組，分別給予UⅡ、UT拮抗劑、對照處理24h。采用細(xì)胞劃痕實驗檢測UⅡ和UT拮抗劑對糖尿病和非糖

3、尿病平滑肌細(xì)胞遷移的差異性影響;CCK-8細(xì)胞增殖實驗對細(xì)胞增殖程度進(jìn)行對比，明確UⅡ?qū)μ悄虿『头翘悄虿∑交〖?xì)胞促增殖作用的差別;提取各組細(xì)胞總蛋白和總mRNA分別行western blot和RT-PCR，明確糖尿病人和非糖尿病人血管平滑肌細(xì)胞中UⅡ和GPR14的差異性表達(dá)。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用組織塊貼壁法培養(yǎng)出人主動脈平滑肌原代細(xì)胞，傳代后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，見細(xì)胞呈梭形或長

4、梭形，可重疊生長，高低不平，呈典型的“峰-谷”樣，這是血管平滑肌細(xì)胞特征性生長方式;免疫熒光鑒定:抗α平滑肌細(xì)胞肌動蛋白（抗α-SMA）見細(xì)胞胞漿顯示綠色熒光，且純度在90％以上。
　　2.CCK-8增殖實驗
　?、匐S著時間的推移，各組OD值在一定范圍內(nèi)逐漸升高;
　　②在糖尿病組（以下簡稱DM組）中，糖尿病UⅡ處理組（以下簡稱UⅡ+DM組）在每個時間點的細(xì)胞增殖活性均顯著高于糖尿病UⅡ受體拮抗組（以下簡稱UT+DM組

5、）(P＜0.01)和糖尿病對照組（以下簡稱DM對照組）(P＜0.01)，UT+DM組細(xì)胞增值活性低于DM對照組(P＜0.05);
　　③在正常組中，UⅡ處理組（以下簡稱UⅡ+正常組）在每個時間點的細(xì)胞增殖活性均高于無糖尿病的UⅡ受體拮抗組（以下簡稱UT+正常組）(P＜0.05)和正常對照組(P＜0.05)，UT+正常組與正常對照組無顯著差別(P＞0.05);
　　④在各時間點，經(jīng)UⅡ處理的DM組的細(xì)胞增殖活性高于UⅡ處理的正

6、常組(P＜0.05)。
　　3.細(xì)胞劃痕實驗
　?、僭谔悄虿〗M中，UⅡ+DM組的細(xì)胞遷移距離顯著大于UT+DM組(P＜0.01)和DM對照組(P＜0.01），UT+DM組小于DM對照組(P＜0.05);
　?、谠谡＝M中，UⅡ+正常組的細(xì)胞平均遷移距離大于UT+正常組(P＜0.05)和正常對照組(P＜0.05），UT+正常組與正常對照組無顯著差別(P＞0.05);
　　③在糖尿病組和正常組之間，UⅡ+DM組的細(xì)胞

7、遷移距離大于UⅡ+正常組(P＜0.05)。
　　4.免疫印跡(Western blot)和RT-PCR
　　①在糖尿病組內(nèi)，UⅡ+DM組中UⅡ和其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量顯著高于UT+DM組(P＜0.01)和DM對照組(P＜0.01)，UT處理組UⅡ及其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量低于DM對照組(P＜0.05);
　?、谡＝M內(nèi)，UⅡ和其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量在UⅡ+

8、正常組中的表達(dá)量也高于UT+正常組(P＜0.05)和正常對照組(P＜0.05)，而它們在UT+正常組中的表達(dá)量與在正常對照組中的表達(dá)量并無顯著差異(P＞0.05);
　?、踀Ⅱ+DM組平滑肌細(xì)胞中UⅡ及其受體GPR14的蛋白表達(dá)量和mRNA表達(dá)量高于UⅡ+正常組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.從全新的角度進(jìn)一步證實UⅡ及其受體GPR14的高表達(dá)與人平滑肌細(xì)胞增殖、遷移密切相關(guān)。
　　2.糖尿病人主動脈平滑

9、肌細(xì)胞對UⅡ的敏感性高于非糖尿病人，更易發(fā)生遷移和增殖，從而更容易導(dǎo)致動脈粥樣硬化發(fā)生，且糖尿病人的動脈粥樣硬化比非糖尿病人的動脈粥樣硬化病變程度重、范圍大。此過程是通過GPR14介導(dǎo)的第二信使通路發(fā)揮復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)所致。
　　3.除了“尾加壓素Ⅱ-GPR14”系統(tǒng)外，可能還存在其他因子通過其他通路或途徑促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而加快動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　4.SB-657510作為一種磺胺類UⅡ受體拮抗