丁苯酞對血管性癡呆小鼠膽堿乙酰轉移酶代謝影響機制的研究.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VD)由于各種腦血管病引起的獲得性認知功能障礙，以學習、記憶功能缺損為主要癥狀。隨著社會人口的日益老齡化和腦卒中治愈率的不斷提高，VD的發(fā)病呈迅速增長趨勢，成為嚴重危害老年人身心健康的常見疾病，給社會和家庭帶來沉重的負擔。目前VD的發(fā)病機制尚未明確，也無特效的防治方法，因此探討和闡明VD的發(fā)病機理，對于臨床制定更加合理的治療方案具有重要的價值和理論意義。 丁苯酞(dl-3n-

2、butylphthalide NBP)系從食用植物芹菜籽中提取并經消旋合成的黃色油狀液體。該藥為國家治療腦缺血的一類新藥，國外對該藥的研究尚未見報道，國內馮亦璞等對丁苯酞治療腦缺血的相關機制做了大量的實驗研究，發(fā)現(xiàn)丁苯酞具有多靶點抗腦缺血作用，能改善線粒體功能，提高腦血管內皮NO和PGI2的水平，抑制谷氨酸釋放，降低細胞內鈣濃度和花生四烯酸含量，抑制自由基和提高抗氧化酶活性，減輕腦缺血所致腦水腫，抗血栓形成和抗血小板聚集，縮小腦梗死面積

3、，改善局部腦血流量和細胞能量代謝、神經功能缺失及腦缺血記憶障礙。作為一種抗腦缺血新藥，丁苯酞已廣泛應用于腦血管病的治療，但該藥對VD的實驗研究尚未見相關報道。 基于此，本實驗通過建立VD模型及觀察其海馬形態(tài)，觀測海馬CHAT的變化，探討VD發(fā)病的膽堿能機制及丁苯酞改善腦缺血，提高VD小鼠學習、記憶的膽堿能藥理機制。 方法： 1.采用三次雙側頸總動脈結扎，造成腦組織反復缺血/再灌注，建立了小鼠VD模型，建立假手術組

4、排除手術本身對小鼠的影響，通過跳臺試驗和水迷富試驗進行學習和記憶成績測試，觀察其行為學改變；用HE染色觀察海馬病理學特征變化。 2.快速斷頭取腦，4％多聚甲醛溶液固定小鼠腦組織，用免疫組化在光鏡下觀察各組小鼠海馬組織CHAT的表達變化，并且計算其海馬CA1區(qū)CHAT陽性細胞的面密度值，比較各組海馬的表達是否差異。 結果： 1.VD小鼠模型的行為學評價及海馬病理學特征2 月齡雄性昆明小鼠56只，隨機分為假手術對照組

5、、VD模型組、丁苯酞預防治療組、丁苯酞治療組。采用雙側頸總動脈結扎，連續(xù)三次腦缺血(20 min)再灌注(10min)，建立VD小鼠模型。術后29d，各組分別進行跳臺試驗及水迷宮實驗，測試學習成績；術后30d測試記憶成績。然后用HE染色觀察各組小鼠海馬組織病理學特征。 1.1 學習成績術后第29天，分別進行跳臺試驗和水迷宮試驗，測試跳臺試驗反應時間(sec)和錯誤次數(shù)(number/5 min)作為學習成績，水迷宮試驗游完全程時

6、間(sec)和錯誤次數(shù)(number/3 min)作為學習成績。 跳臺試驗結果顯示：(1)與假手術對照組的反應時間(48.76±9.24)s比較，VD模型組小鼠學習階段的反應時間(89.41±12.08)s明顯延長(P<0.01)；(2)與VD模型組的反應時間比較，丁苯酞治療組小鼠學習階段的反應時間(59.68±10.27)s及丁苯酞預防治療組小鼠學習階段的的反應時間(57.23±10.05)s均明顯縮短(P<0.01)；(3)

7、與假手術對照組的錯誤次數(shù)(1.23±0.27)比較，VD模型組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(3.74±0.42)明顯增加(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(1.52±0.38)及丁苯酞預防治療組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(1.48±0.31)均明顯減少(P<0.01)；(5)假手術對照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預防治療組之間的學習成績無顯著性差異(P>0.05)。 水迷宮試驗結果顯示：(1

8、)與假手術對照組的游全程時間(87.32±13.46)s比較，VD模型組小鼠學習階段的游全程時間(145.80±13.29)s明顯延長(P<0.01)；(2)與VD模型組的游全程時間比較，丁苯酞治療組小鼠學習階段的游全程時間(101.89±18.38)s及丁苯酞預防治療組小鼠學習階段的游全程時間(99.18±11.25)s明顯縮短(P<0.01)；(3)與假手術對照組的錯誤次數(shù)(16.88±4.19)比較，模型組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(

9、34.60±5.92)明顯增多(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(18.71±4.35)及丁苯酞預防治療組小鼠學習階段的錯誤次數(shù)(17.29±4.82)明顯減少(P<0.01)；(5)假手術對照組、丁苯酞預防治療組、丁苯酞治療組的學習成績之間無顯著性差異(P>0.05)。以上結果提示VD模型小鼠的學習成績降低，丁苯酞可以改善其學習成績。 1.2記憶成績術后第30天，分別進行跳臺

10、試驗和水迷宮試驗，測試跳臺試驗潛伏時間(sec)和錯誤次數(shù)(number/5min)作為記憶成績，水迷宮試驗游完全程時間(sec)和錯誤次數(shù)(number/3min)作為記憶成績。 跳臺試驗結果顯示：(1)與假手術對照組的潛伏時間(148.92±20.83)s比較，VD模型組小鼠記憶階段的潛伏時間(78.67±19.17)s明顯縮短(P<0.01)；(2)與VD模型組的潛伏時間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的潛伏時間(131.4

11、1±18.82)s及丁苯酞預防治療組小鼠記憶階段的的潛伏時間(128.57±18.29)s均明顯延長(P<0.01)；(3)與假手術對照組的錯誤次數(shù)(0.32±0.05)比較，VD模型組小鼠記憶階段的錯誤次數(shù)(1.72±0.13)明顯增加(P<0.01)；(4)與VD模型組的錯誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯誤次數(shù)(0.54±0.08)及丁苯酞預防治療組小鼠記憶階段的的錯誤次數(shù)(0.50±0.07)均明顯減少(P<0.01)；(

12、5)假手術對照組、丁苯酞預防治療組、丁苯酞治療組之間的記憶成績無顯著性差異(P>0.05)。結果提示VD模型小鼠的記憶成績降低，丁苯酞可以改善其記憶成績。水迷宮試驗結果顯示：(1)與假手術對照組的游全程時間(67.82±8.79)比較，VD模型組小鼠記憶階段的游全程時間(137.40±11.86)明顯延長(P<0.01)；(2)與VD模型組的游全程時間比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的游全程時間(88.73±9.53)及丁苯酞預防治療組小

13、鼠記憶階段的游全程時間(83.87±8.62)明顯縮短(P<0.01)；(3)與假手術對照組的錯誤次數(shù)(9.57±2.91)比較，模型組小鼠記憶階段的錯誤次數(shù)(20.90±4.25)明顯增多。(P<0.01)；(4)與VD模型繾的錯誤次數(shù)比較，丁苯酞治療組小鼠記憶階段的錯誤次數(shù)(11.17±3.04)及丁苯酞預防治療組小鼠記憶階段的錯誤次數(shù)(10.27±2.83)明顯減少(P<0.01)；(5)假手術對照組、丁苯酞治療組、丁苯酞預防治療

14、組的記憶成績之間無顯著性差異(P>0.05)。 以上結果提示VD模型小鼠的記憶成績降低，丁苯酞可以改善其記憶成績。 1.3 VD小鼠海馬病理學改變在光鏡下，(1)假手術對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體纓胞核大而圓，核仁明顯，細胞排列較致密整齊。(2)相比之下，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞松散，層次不清，有細胞缺失現(xiàn)象；炎性細胞浸潤；部分細胞旁有空染區(qū)，核固縮、胞質濃染、胞體變小，并且有膠質細胞增生形成結節(jié)。(3)丁苯酞治

15、療組和預防治療組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列尚整齊，未發(fā)現(xiàn)炎性細胞浸潤，核固縮現(xiàn)象較少見。 2.VD小鼠海馬CA1區(qū)CHAT表達水平及丁苯酞的影響2.1 CHAT免疫組化染色小鼠10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，石蠟包埋，冠狀切片，采用SP法行免疫組化染色，觀察CHAT陽性神經元數(shù)目的變化。結果顯示：(1)與假手術對照組海馬CA1區(qū)CHAT陽性神經元面密度值為：(0.1178±0.0104)比較，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)CHA

16、T陽性神經元面密度值(0.0823±0.0236)明顯減少(P<0.05)；(2)與VD模型組比較，丁苯酞治療組小鼠海馬CA1區(qū)CHAT陽性神經元面密度值(0.1097±0.0131)和丁苯酞預防組小鼠海馬CA1區(qū)CHAT陽性神經元面密度值(0.1116±0.0135)明顯增多(P<0.05)；(3)丁苯酞治療組、丁苯酞預防治療組、假手術對照組海馬CA1區(qū)CHAT陽性神經元面密度之間無明顯差異(P>0.05)。此可以提示VD小鼠海馬CA

17、1區(qū)GHAT水平降低參與了VD的發(fā)病機制，丁苯酞和丁苯酞預防治療組可以防止VD小鼠海馬CA1區(qū)CHAT水平表達下降而促進其學習和記憶成績的改善。 結論： 1.本實驗建立的VD小鼠模型可模擬人類VD以學習和記憶能力缺損為主的認知功能障礙，是研究VD比較理想的動物模型，對深入研究VD是可行的。VD模型小鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)病理性變化。 2.VD小鼠海馬CHAT蛋白表達水平降低，與其學習和記憶成績下降相一致，提示CHAT