雙重PCR和競爭性PCR檢測馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌技術體系建立.pdf

1、馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物,我國為世界第一大馬鈴薯生產國。馬鈴薯環(huán)腐病(Clavibacter michiganensis subsp.Sepedonicus,Cms)和黑脛病(Pectobacterium atroseptica,Eca)是影響馬鈴薯生產的兩個重要的種薯傳播細菌性病害,能夠快速、準確、靈敏、可靠地檢測這兩種病害對降低種薯帶菌減輕病害發(fā)生具有重要意義。本研究建立了雙重PCR檢測黑脛病菌和環(huán)腐病菌

2、技術和競爭性PCR定量檢測黑脛病菌技術。
　　 主要研究結果如下:
　　 1.根據GenBank上發(fā)表的馬鈴薯環(huán)腐病菌pCS1質粒上纖維素酶A基因序列,對比近緣種及馬鈴薯上幾種重要病原細菌的核苷酸序列,設計并合成了一對特異性引物CMS1／CMS2,利用引物CMS1／CMS2擴增出了一條913bp的馬鈴薯環(huán)腐病菌特異性條帶,而馬鈴薯環(huán)腐病菌近緣種和馬鈴薯上的重要病原菌均未擴增出任何條帶,特異性很高。檢測靈敏度在DNA水平

3、上達100fg／μL,在細菌數量上達105CFU／mL。
　　 2.將設計的引物CMS1／CMS2與已發(fā)表的PCR檢測馬鈴薯黑脛病菌特異性引物ECA1f／ECA2r結合,經過條件優(yōu)化后,成功建立了雙重PCR技術體系。利用該雙重PCR體系對馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌進行擴增,可獲得913bp和690bp的2條特異性條帶,而15種對照菌株均未擴增出任何條帶,檢測靈敏度在DNA水平上達600fg／μL,在細菌數量上達5×105CFU／m

4、L。應用該體系對患環(huán)腐病和(或)黑脛病的薯塊進行了檢測,能夠檢測到環(huán)腐病菌和(或)黑脛病菌的存在。實現了同時對馬鈴薯環(huán)腐病菌和黑脛病菌的快速可靠檢測。
　　 3.應用黑脛病菌特異性引物ECA1f／ECA2r擴增黑脛病菌DNA,將擴增產物克隆測序。根據擴增產物序列和引物ECA1f／ECA2r序列,設計了新引物ECA3f,與ECA2r組合擴增黑脛病菌DNA,制備競爭性模板。將競爭性模板插入。pEASY-T1克隆載體,導入Trans1