香煙煙霧和氡吸入染毒致大鼠支氣管肺組織蛋白質(zhì)組表達的改變.pdf

1、目的：從蛋白質(zhì)組學角度研究香煙煙霧和氡吸入染毒對大鼠支氣管和肺損傷的早期生物學效應。尋找香煙煙霧和氡暴露所致蛋白質(zhì)組的變化，為吸煙和氡暴露危害的早期診斷提供基礎資料。 方法： (1)建立雙向電泳技術，比較大鼠肺組織總蛋白經(jīng)不同長度和pH值IPG膠條分離后2-DE圖譜的效果。(2)采用動式氣體染毒裝置對Wistar大鼠進行香煙煙霧染毒，裝置內(nèi)煙霧濃度控制在(20±5)％，氧氣濃度控制在25％，每天染毒2次，每次30min，分別染毒

2、1、2、4個月作為低、中、高劑量組。染毒后分別提取大鼠氣管-支氣管上皮細胞和肺組織的總蛋白，進行雙向電泳分析。細胞總蛋白進行2-DE分離，硝酸銀染色，尋找差異表達點；肺組織總蛋白進行2-DE分離，考馬斯亮藍染色，差異表達點進行MALDI-TOF或MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，NCBInr數(shù)據(jù)庫搜索鑒定分析結(jié)果。(3)多功能生態(tài)氡室對Wistar大鼠進行氡及其子體染毒，通過計算機控制裝置內(nèi)氡濃度使其劑量率恒定，保持在100000Bq

3、/KL，每天染毒16h。氡及其子體累積染毒劑量分別達100、200、400WLM作為低、中、高劑量組，染毒后提取大鼠肺組織總蛋白進行2-DE分離，考馬斯亮藍染色，差異表達點進行MALDI-TOF或MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，NCBlnr數(shù)據(jù)庫搜索鑒定分析結(jié)果。(4)對質(zhì)譜鑒定出的差異表達蛋白質(zhì)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和硫氧還蛋白(TRX)進行Western blot分析，以GAPDH為內(nèi)參，分析RAGE和TRX在上述各組

4、染毒大鼠肺組織中的表達量，以Bandscan4.3分析軟件進行灰度分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以t檢驗進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：(1)建立了肺組織總蛋白的雙向電泳分離技術。銀染法中，pH3～10，11cm的膠條分離到約450個蛋白質(zhì)點，pH3～10，24cm的膠條分離到約625個蛋白質(zhì)點，pH4～7，24cm的膠條分離到約1248個蛋白質(zhì)點。在pH3～10的圖譜上中間一部分蛋白點重疊，分離效果不太好，但在pH4～7的圖譜中蛋白點分離效果較好，提示

5、肺組織蛋白中中性pH范圍的蛋白較多，確定肺組織蛋白雙向電泳采用pH4～7，24cm的膠條進行2-DE分離。對大鼠肺組織蛋白進行的3次pH4～7，24cm膠條的雙向電泳實驗中，獲得了分離效果和重復性較好的2-DE圖譜。(2)建立了香煙煙霧染毒大鼠模型。病理切片結(jié)果顯示各組大鼠肺氣腫癥狀和支氣管炎癥反應逐漸加重，高劑量組膠原纖維明顯增多。氣管．支氣管上皮細胞雙向電泳銀染法共發(fā)現(xiàn)23個差異表達蛋白點，其中11個點劑量-效應關系明顯。肺組織總蛋

6、白經(jīng)2-DE分離、質(zhì)譜分析，共鑒定出18種差異蛋白，包括10個上調(diào)的蛋白(β-肌動蛋白、2型角蛋白、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)、丙酮酸脫氫酶(PDH)、硫氧還蛋白(TRX)、ATP合酶、過氧化還原蛋白(PRX6)、dnaK分子伴侶蛋白(HSP70)、膜突蛋白、膜聯(lián)蛋白Ⅲ)，8個下調(diào)的蛋白質(zhì)(原肌球蛋白4(TM4)、肌球蛋白輕鏈多肽(MLP4)、絲氨酸蛋白酶抑制劑B11(SERPIN B11)、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDA

7、H1)等)。(3)建立了氡及其子體染毒大鼠模型。病理切片顯示各組大鼠病理變化主要為肺間質(zhì)充血水腫、間隔增厚、炎癥細胞浸潤、膠原纖維逐漸增多，出現(xiàn)不同程度的肺氣腫。肺組織總蛋白經(jīng)2-DE分離、質(zhì)譜分析，共鑒定出15種差異蛋白，包括9個染氡后上調(diào)的蛋白(鋅指蛋白4、a-烯醇酶、微管蛋白β、HSP27、β-肌動蛋白、硫氧還蛋白(TRX)、RAGE、S100A6、膜聯(lián)蛋白A2)，6個染氡后下調(diào)的蛋白質(zhì)(細胞色素C氧化酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑、γ-

8、肌動蛋白、醛脫氫酶(ALDH)、肌球蛋白輕鏈多肽4(MLP 4)、LOC500450等)。(4)Western blot分析結(jié)果提示RAGE和TRX在香煙煙霧染毒及氡染毒各組大鼠肺組織中均有較好的劑量．反應關系，與2-DE結(jié)果一致。 結(jié)論：建立了大鼠肺組織總蛋白的雙向電泳技術，在此基礎上測定了香煙煙霧和氡吸入染毒后大鼠支氣管肺組織的蛋白質(zhì)組表達。表達相同的蛋白有RAGE、TRX、Seroin、Annexin等，香煙煙霧染毒差異表