模擬調(diào)強(qiáng)放療模式對(duì)人鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株生物效應(yīng)影響研究.pdf

1、目的：鼻咽癌是人類常見的惡性腫瘤之一，尤其在我國(guó)南方高發(fā)，放射治療作為首選治療。調(diào)強(qiáng)放射治療（intensity-modulated radiation therapy IMRT）技術(shù)作為先進(jìn)放療技術(shù)的代表，突破了傳統(tǒng)常規(guī)放療的規(guī)則大野照射，以不規(guī)則的多個(gè)子野從多個(gè)角度在保護(hù)危及器官及正常組織的同時(shí)，最大限度的給予腫瘤區(qū)域以較高劑量照射；IMRT還可實(shí)現(xiàn)同時(shí)補(bǔ)量技術(shù)，在治療次數(shù)相同的情況下，給不同的靶區(qū)不同劑量。以期提高局控率并減少周圍

2、正常組織損傷，因而成為臨床腫瘤放射治療走向精確定位、精確計(jì)劃設(shè)計(jì)、精確治療的標(biāo)志。近年來(lái)，IMRT因其技術(shù)優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤放射治療實(shí)踐中，如頭頸部腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等。IMRT在物理學(xué)上的優(yōu)勢(shì)是顯而易見的。關(guān)于IMRT放療近期療效的報(bào)道很多，而且大多數(shù)結(jié)果尚屬滿意，但至今沒(méi)有大范圍的、有說(shuō)服力的這種治療改善了預(yù)后的資料。因此推測(cè)這一技術(shù)在在生物學(xué)上可能存在不足之處。因?yàn)橹委熂夹g(shù)的復(fù)雜性，使在常規(guī)照射時(shí)一次性給予的劑量分成

3、了多次給予，尤其是MLC靜態(tài)IMRT技術(shù)大大延長(zhǎng)了照射時(shí)間。常規(guī)2Gy的照射1～2min即可完成，而IMRT則常常需要20～40min。這樣單位時(shí)間內(nèi)腫瘤吸收劑量就大大降低，有人將這種情況稱為“相對(duì)劑量率降低”。這種照射模式所致“相對(duì)劑量率降低是否影響腫瘤細(xì)胞的殺滅”已成為臨床放射生物學(xué)的熱點(diǎn)問(wèn)題。多年來(lái)，人們應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組化、分子生物學(xué)技術(shù)等對(duì)腫瘤細(xì)胞相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了研究，積累了大量資料。也有作者就離體細(xì)胞IMRT照射

4、后，細(xì)胞存活曲線的變化進(jìn)行過(guò)研究，從而推斷IMRT照射時(shí)間延長(zhǎng)，可能導(dǎo)致亞致死性損傷修復(fù)增加，放射生物效應(yīng)降低，但其確切影響仍不清楚，未見其他方面深入的報(bào)道。放射治療模式的改變是否會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生物效應(yīng)尚未明確，是否要對(duì)IMRT照射模式進(jìn)行劑量補(bǔ)償亦尚未定論。文獻(xiàn)報(bào)道，影響細(xì)胞放射敏感性的生物因素主要包括DNA損傷的修復(fù)、細(xì)胞周期、及細(xì)胞凋亡。因此本研究旨在通過(guò)給予人鼻咽低分化鱗癌細(xì)胞株（CNE-2）不同模式照射，探索IMRT治療模式

5、對(duì)CNE-2生物效應(yīng)的影響。為今后IMRT在臨床上的廣泛應(yīng)用，放療劑量的調(diào)整，縮短照射時(shí)間，從而提高腫瘤局控率，進(jìn)一步提高遠(yuǎn)期生存率，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并依據(jù)檢測(cè)指標(biāo)的變化，為患者制定個(gè)體化的放療方案，如：確定分割劑量，選擇照射時(shí)間，提供理論依據(jù)。
　　 方法：選取CNE-2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分為空白對(duì)照、常規(guī)照射、模擬IMRT（按設(shè)計(jì)要求對(duì)各個(gè)照射劑量點(diǎn)進(jìn)行照射，每個(gè)劑量點(diǎn)分5 次照射,其間分別間隔8.0-8.5min， 35min完成

6、）3組，分別給予6MV-X 2、4、6、8Gy4個(gè)劑量點(diǎn)的照射；1）運(yùn)用克隆形成實(shí)驗(yàn)（courtenay assay），檢測(cè)不同照射模式下CNE-2的存活分?jǐn)?shù)； 2）運(yùn)用四氮唑藍(lán)法（MTT）進(jìn)一步驗(yàn)證克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；3）運(yùn)用流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)不同照射模式下CNE-2的細(xì)胞周期分布及凋亡比例；4）應(yīng)用RT-PCR及Western blotting方法，檢測(cè)CNE-2在不同照射模式下，與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的Ku、ATM轉(zhuǎn)錄水平及蛋

7、白表達(dá)；檢測(cè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的Cyclin B1、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)，檢測(cè)與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)的Bcl2、Bax的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．克隆形成檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)：
　　 1）CNE-2 α/β值為13.177Gy，在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組：SF值分別為0.225,3±0.017,7、0.013±0.002,0、0.002,6±0.000,6和0.0,002

8、±0.000,1，模擬IMRT組：SF分別為0.335,3±0.016,7、0.060,7±0.009,3、0.006,9±0.000,9和0.000,6±0.0,003；模擬IMRT組的SF均高于常規(guī)照射組。
　　 2）根據(jù)線性二次方程擬合的CNE-2細(xì)胞存活曲線，常規(guī)放療組：α、β、N、D0、Dq值分別為0.674,8、0.051,2、1.890,0、0.885,0、0.563,0，模擬IMRT組：α、β、N、D0、Dq值分

9、別為0.537,7、0.026,8、2.610,0、0.986,0和0.946,0；α常規(guī)＞αIMRT，β常規(guī)＞βIMRT，N常規(guī)〈N IMRT，D0常規(guī)＜D0IMRT，Dq 常規(guī)＜DqIMRT。
　　 2．MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖比例：
　　 CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組：細(xì)胞增殖比例分別為0.598,7±0.021,7、0.455,7±0.053,7、0.235,3±0.045,3、0.056,7±0.

10、018,3；模擬IMRT組：細(xì)胞增殖比例分別為0.682±0.055,0、0.528,3±0.074,3、0.322,3±0.002,0、0.091,7±0.022,3；模擬IMRT組的增殖比例均高于常規(guī)照射組。
　　 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布(%)：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)
　　 1）常規(guī)照射組：G2期細(xì)胞比例分別為26.77±0.43、38.33±1.77、46.57±1.43、66.97±1.47

11、；模擬IMRT組：G2期細(xì)胞比例分別為21.07±0.87、30.83±1.67、39.47±3.03、56.87±2.50；在8Gy劑量點(diǎn)時(shí)，2組的CNE-2 G2期細(xì)胞比例均高達(dá)50%以上（66.97±1.47%與56.87±2.50%）。G2期細(xì)胞比例隨照射劑量的增加而逐漸增加；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組G 2期細(xì)胞比例低于常規(guī)照射組。
　　 2）常規(guī)照射組：S期細(xì)胞比例37.50±0.20、26.47±0.97、19.

12、23±0.97、13.67±0.73；模擬IMRT組：S期細(xì)胞比例分別為39.73±0.47、32.43±1.03、26.07±2.77、16.87±2.33。S期細(xì)胞比例隨照射劑量的增加而逐漸減少；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組的S期細(xì)胞比例高于常規(guī)照射組。
　　 3）常規(guī)照射組：G1期細(xì)胞比例分別為35.73±0.23、35.20±0.80、34.20±0.50、19.37±0.73；模擬IMRT組：G1期細(xì)胞比例分別為39.

13、20±0.40、36.73±0.63、34.47±0.33、26.27±0.27。G1期細(xì)胞比例隨照射劑量的增加無(wú)明顯變化；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組的G1期細(xì)胞比例略高于常規(guī)照射組。
　　 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例及存活比例（%）：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)
　　 1）常規(guī)照射組：早期凋亡比例分別為13.67±1.63、21.07±1.73、28.87±3.33、16.47±1.83；模擬IMRT組：

14、早期凋亡比例分別為10.60±1.20、15.77±0.43、21.30±2.10、29.97±4.47；2Gy、4Gy、6Gy三個(gè)照射劑量點(diǎn)，早期凋亡比例隨照射劑量的增加而逐漸增加；照射劑量為8Gy時(shí)，隨劑量的增加，常規(guī)照射組早期凋亡比例不再增加反而下降；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組的早期凋亡比例低于常規(guī)照射組（8Gy除外）。
　　 2）常規(guī)照射組：晚期凋亡比例分別為3.33±0.67、10.57±1.73、25.10±3.4

15、0、70.20±2.90；模擬IMRT組：晚期凋亡比例分別為1.80±0.90、7.13±1.37、21.77±2.47、59.37±3.67。晚期凋亡比例隨照射劑量的增加成倍增加；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組的晚期凋亡比例低于常規(guī)照射組。
　　 3）常規(guī)照射組：存活比例分別為82.83±1.67、47.40±4.90、21.73±6.93、5.13±1.37；模擬IMRT組：存活比例分別為87.40±2.10、54.70±3.

16、50、27.80±5.30、7.57±1.77。細(xì)胞存活比例隨照射劑量的增加而降低；在相同劑量點(diǎn)，模擬IMRT組的存活比例高于常規(guī)照射組。
　　 5．RT-PCR、Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Ku80、ATM的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)
　　 1）常規(guī)照射組：Ku80的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.588±0.131、0.929±0.125、0.840±0.084、0.775±0

17、.084；模擬IMRT組：Ku80的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.730±0.097、1.074±0.104、0.961±0.076、0.911±0.071；各組不同劑量點(diǎn)之間Ku80的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.000）；在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，4個(gè)劑量點(diǎn)Ku80的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；接受照射后CNE-2 Ku80轉(zhuǎn)錄水平升高，模擬IMRT組Ku80的轉(zhuǎn)錄水平更高（P均=0.0

18、00），在4Gy劑量點(diǎn)時(shí)2組細(xì)胞Ku80的轉(zhuǎn)錄水平到達(dá)峰值，隨后表達(dá)均下降。
　　 2）常規(guī)照射組：ATM轉(zhuǎn)錄水平分別為0.908±0.110、1.057±0.313、0.923±0.133、0.823±0.075；模擬IMRT組：ATM的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.732±0.189、0.903±0.181、0.871±0.067、0.775±0.130；接受照射后，與空白對(duì)照比較，2組CNE-2 ATM轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)（P均＜0.005

19、）；各組不同劑量點(diǎn)之間，ATM的轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，ATM的轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　 Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Ku80、ATM的蛋白表達(dá)均得到相似結(jié)果。
　　 6．PT-PCR、Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白

20、表達(dá)：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)
　　 1）常規(guī)照射組：Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.745±0.068、0.624±0.100、0.518±0.054、0.428±0.038；模擬IMRT組：Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.881±0.075、0.711±0.054、0.617±0.061、0.528±0.046；2組Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄水平隨照射劑量的增加而降低；各組不同劑量點(diǎn)之間，Cyclin

21、B1的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.000）；且在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），模擬IMRT組Cyclin B1的轉(zhuǎn)錄水平高于常規(guī)照射組。
　　 2）常規(guī)照射組：Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.857±0.090、0.810±0.327、0.798±0.303、0.802±0.038；模擬IMRT組：Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄

22、水平分別為0.822±0.063、0.701±0.213、0.812±0.093、0.801±0.064，各組不同劑量點(diǎn)之間轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　 Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表達(dá)均得到相似結(jié)果。
　　

23、 7．PT-PCR、Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Bcl2、Bax的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)：CNE-2在2、4、6、8Gy劑量點(diǎn)
　　 1）常規(guī)照射組： Bcl2的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.298±0.029、0.308±0.024、0.290±0.033、0.273±0.025；模擬IMRT組：Bcl2的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.313±0.030、0.297±0.028、0.294±0.021、0.293±0.025；各組

24、不同劑量點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Bcl2的轉(zhuǎn)錄水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　 2）常規(guī)照射組：Bax的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.618±0.061、0.706±0.032、0.817±0.064、0.915±0.076；模擬IMRT組：Bax的轉(zhuǎn)錄水平分別為0.513±0.051、0.606±0.087、0.662±0.132、0.

25、721±0.086；2組Bax的轉(zhuǎn)錄水平隨照射劑量的增加而升高；各組不同劑量點(diǎn)之間，Bax的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均=0.000）；在相同劑量點(diǎn)，常規(guī)照射組與模擬IMRT組LSD法兩兩比較，Bax的轉(zhuǎn)錄水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），模擬IMRT組Bax的轉(zhuǎn)錄水平低于常規(guī)照射組。
　　 Western blotting方法檢測(cè)CNE-2 Bcl2、Bax的蛋白表達(dá)均得到相似結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　

26、　 1．照射時(shí)間延長(zhǎng)，CNE-2存活分?jǐn)?shù)增加，提示對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅減少，在此期間可能發(fā)生亞致死性損傷修復(fù)，放射敏感性下降，放射生物效應(yīng)降低。
　　 2．電離輻射誘導(dǎo)CNE-2 G2期阻滯，其阻滯作用隨劑量增加而增加；模擬IMRT照射時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)G2期細(xì)胞阻滯作用減弱。電離輻射誘導(dǎo)CNE-2凋亡，細(xì)胞凋亡比例隨照射劑量的增加而增加，細(xì)胞存活比例隨照射劑量的增加而降低。模擬IMRT照射時(shí)間延長(zhǎng)，CNE-2凋亡比例下降及存活比例均

27、上升，導(dǎo)致輻射生物效應(yīng)降低。流式細(xì)胞術(shù)較好地反映了輻射對(duì)CNE-2細(xì)胞周期分布及凋亡比例的影響。
　　 3．應(yīng)用RT-PCR、Western blotting方法檢測(cè)ATM、Ku80、Cyclin D1、Cyclin B1、Bcl2及Bax的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)，并計(jì)算 Bcl2/Bax的比值，可能有助于評(píng)價(jià)CNE-2放射生物效應(yīng)的改變。IMRT時(shí)間延長(zhǎng)，可能有利于SLDR，降低放射敏感性。DNA損傷修復(fù)相關(guān)因子Ku80、ATM，