胃癌組織中miR-191的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　自1993年在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個microRNA（miRNA）—Lin-4以來，miRNA逐漸受到科學家們的關(guān)注。它們是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA（ncRNA），通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同在轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因的翻譯進行抑制或降解靶mRNA。大量的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。隨著對miRN

2、A的研究的深入，眾多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的形成中發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。目前許多國內(nèi)外的學者對miRNA在多種腫瘤中的表達及其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預后的關(guān)系進行了相關(guān)的研究工作。但關(guān)于miRNA在胃癌中表達情況的研究尚需加強。
　　有研究者利用基因芯片技術(shù)檢測出miR-191在多種腫瘤中呈異常表達，其中在胃癌呈高表達，但利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR

3、）等檢測方法對其結(jié)果的驗證尚缺乏，與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系所知尚少，而且，miR-191在胃癌中是通過哪個靶基因發(fā)揮作用更是尚未有相關(guān)報道。
　　目的：
　　1．用實時熒光定量PCR檢測miR-191在胃癌中的表達情況，并分析與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系。
　　2.利用生物信息學軟件預測miR-191的靶基因。
　　3.用免疫組化方法對靶基因在胃癌組織中表達情況進行檢測，分析miR-191與靶基因表達情況的關(guān)系，

4、為miR-191的后續(xù)功能研究提供重要依據(jù)。
　　方法：
　　1.選取胃癌及配對癌旁正常組織(距癌腫5cm以上)標本50例提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，應用基于LNA技術(shù)的qRT-PCR（SYBR GreenⅠ染料法）及2-ΔΔCT相對定量法檢測miR-191在胃癌及配對癌旁正常組織的表達情況。
　　2.按照不同的臨床病理特征（性別、年齡、病理組織學分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期）對胃癌病人進行分組，通過組間對比分析

5、miR-191與各臨床、病理指標的關(guān)系。
　　3.利用相關(guān)生物信息學軟件（MiRanda、TargetScan及 PicTar）對miR-191進行靶基因預測，取3個軟件均預測到的基因作為靶基因。
　　4.用免疫組化對靶基因在胃癌和配對癌旁正常組織中的表達情況進行檢測，并分析與miR-191表達情況的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示：應用2-ΔΔCT進行相對定量分析，與配對癌旁正常組織相比，6

6、8％（34/50例）胃癌組織的miR-191呈高表達，miR-191在胃癌組織中的表達量0.0314（0.0037~0.4924）是配對正常組織0.0240（0.0037~0.1593）的2.01倍，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2.按性別、年齡、病理組織學分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期對胃癌病人分別進行分組，各組間miR-191表達情況均無顯著差異性（P>0.05）。
　　3.有9個基因在三個軟件中均被預測為miR-1

7、91的靶基因，它們是：PLCD1、SOX4、RNF139、FZD5、GAP43、TJP1、TMOD2、NDST1和AMMECR1。
　　4.對胃癌及配對癌旁正常組織的PLCD1進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)PLCD1均在上皮細胞胞漿染色表達。96.7%（29/30例）癌旁正常組織中的PLCD1表達呈（+）或（++），而胃癌組織中僅56.7%（17/30例）表達（+）或（++），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與配對正常組織相比，70%（

8、21/30）胃癌組織中的PLCD1表達陰性或強度下降。有90%（18/20例）miR-191表達增高的胃癌組織中PLCD1表達強度下降，而只有30%（3/10）miR-191表達降低的胃癌組織中 PLCD1表達強度下降。對miR-191與PLCD1在胃癌組織中表達水平進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者呈顯著負相關(guān)（r=-0.639，P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.本實驗應用基于LNA技術(shù)的qRT-PCR（染料法SYBR Gr

9、eenⅠ）驗證了miR-191在胃癌組織中呈高表達。
　　2. miR-191在胃癌組織中的表達量與相關(guān)的臨床病理特征（性別、年齡、病理組織學分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期）無相關(guān)性。
　　3.利用生物信息學軟件預測了9個基因（PLCD1、SOX4、RNF139、FZD5、GAP43、TJP1、TMOD2、NDST1和AMMECR1）為miR-191的靶基因。
　　4.運用免疫組化方法觀察到PLCD1在胃癌組織中呈低表達