中藥雷公藤內(nèi)酯醇、尿多酸肽對地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細胞株的作用及機制的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開： 第一部分雷公藤內(nèi)酯醇通過影響細胞生存信號通路及激素受體表達誘導(dǎo)對地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡 目的： 探討雷公藤內(nèi)酯醇對地塞米松耐藥及敏感的多發(fā)性骨髓瘤細胞株MM．1R、MM．1S細胞的作用機制并探討其作用機制。 方法： 采用MTT比色法研究雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)對MM．1R、MM．1S細胞株以及對常規(guī)化療方案VAD方案治療無效的MM患者的骨髓單個核細胞的體

2、外生長抑制作用；采用Wright—Giemsa染色、DNA凝膠電泳檢測DNALadder的條帶、流式細胞儀PI染色檢測亞G1峰和AnnexinV/PI雙染色等方法檢測細胞凋亡；采用流式細胞儀JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位的改變；Western—blot檢測TPL作用后MM．1R、MM．1S細胞Caspase家族蛋白，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，凋亡抑制蛋白IAPs家族蛋白的表達，并進一步加用Caspase-3抑制劑Z—DEVD—FMK

3、來觀察實驗結(jié)果；提取核漿蛋白以觀察TPL作用對NF—κB信號通路的影響，并應(yīng)用免疫熒光方法來檢測TPL對NF—κB核轉(zhuǎn)位過程的影響；Western—blot檢測TPL對MM．1R、MM．1S細胞：PI3K/Akt和NF—κB信號通路相關(guān)生存蛋白的影響，并進一步加用PI3K抑制劑LY294002和NF—κB抑制劑PDTC來明確兩條信號通路的相關(guān)性及機制；用RT—PCR方法檢TPL對編碼PI3Kp110α、胰島素樣生長因子-1受體(Insu

4、lin—likegrowthfactor-1receptor，IGF-1R)蛋白的PIK3CA、IGF1R基因的影響，以明確TPL治療的上游靶點。加用白介素-6(Interleukin-6，IL-6)來明確TPL抑制MM．1細胞生長的效應(yīng)是否能被減弱，并探討TPL增加MM．1R、MM．1S細胞株對Dex的敏感性與激素受體(GlucocorticoidReceptor．GR)之間的關(guān)系。從microRNA水平、mRNA、蛋白水平檢測MM．

5、1R、MM．1S細胞株的GR在TPL作用前后的改變。 結(jié)果： ①TPL可以抑制人MM細胞株MM．1S和對Dex耐藥的MM．1R細胞株的生長；TPL還可抑制難治的MM患者原代細胞的生長，均呈濃度和時間依賴性。②TPL可以誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細胞凋亡，并呈濃度依賴性；TPL作用后可產(chǎn)生典型的DNALadder條帶。③不同濃度TPL作用可以激活Caspase-9，-3，呈濃度依賴性，并伴有明顯的線粒體膜電位下降；當(dāng)TPL

6、濃度為10ng/mL時激活Caspase-8，亦呈濃度依賴性；Caspase-3抑制劑可以抑制TPL誘導(dǎo)的MM．1R、MM．1S細胞凋亡．④不同濃度TPL作用可以下調(diào)Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl—xl、Mcl-1、p—Bad和上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，呈濃度依賴性；還可上調(diào)Smac的表達，呈濃度依賴性。⑤TPL可以抑制MM．1R、MM．1S細胞株IAPs家族中的cIAP1，xIAP和Survivin的表達，呈濃度依賴性。⑥TPL抑制

7、MM．1R、MM．1S細胞株的IKBα磷酸化和NF—κB核轉(zhuǎn)位過程。⑦TPL可降低IGF-1R基因及蛋白水平的表達，下調(diào)PIK3CAmRNA表達，抑制PI3K/Akt信號途徑；PI3K抑制劑LY294002與TPL聯(lián)用可以明顯抑制p—Akt表達，并進一步影響其下游的信號途徑，包括NF—κB信號通路的蛋白而誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細胞凋亡。⑧TPL抑制MM．1R、MM．1S細胞生長的效應(yīng)不受IL-6的影響，還可以增加MM．1R、MM．1

8、S細胞對地塞米松及蛋白酶體抑制劑PS341的敏感性。⑨不同濃度TPL處理后可降低GR相關(guān)NmicroRNAN表達，增加MM．1R、MM．1S細胞株的GR基因、p—GR(磷酸化GR)蛋白及GR直接靶基因：激素誘導(dǎo)鋅指蛋白(glucocorticoid—inducedleucinezipper—GILZ)的表達。 小結(jié)： ①TPL可以抑制MM．1S和對Dex耐藥的MM．1R細胞株及MM原代細胞生長，呈時間和劑量依賴性，并且該

9、抑制作用不能被IL-6減弱。②TPL通過啟動內(nèi)源性和外源性細胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細胞凋亡，并以內(nèi)源性(線粒體)途徑為主，伴有明顯的線粒體膜電位下降。③TPL通過下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl—xl、Mcl-1、p—Bad，上調(diào)Bax蛋白的表達以及抑制IAPs家族cIAP1、xIAP和Survivin的表達導(dǎo)致線粒體損傷和Caspase-9，-3激活，誘導(dǎo)細胞凋亡。④TPL通過抑制IκBα磷酸化，從而抑制NF—κB核轉(zhuǎn)位；

10、TPL對MM．1R、MM．1S細胞株NF—κB信號通路的影響主要通過對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控來實現(xiàn)。⑤TPL降低IGF-1R基因及蛋白水平的表達；減少PIK3CA基因的表達而抑制PI3K/Akt信號通路，并進一步通過影響其下游的信號途徑，如NF—κB信號通路等而誘導(dǎo)MM．1R、MM．1S細胞凋亡。⑥TPL下調(diào)MM．1R、MM．1S細胞內(nèi)GR相關(guān)的成熟體microRNA(miR-181a、miR-142-5p)的表達，增加p—GR

11、及GILZ的表達，并且該效應(yīng)不能被IL-6拮抗，從而增加MM．1R、MM．1S細胞對Dex的敏感性。TPL還可增加MM．1R、MM．1S細胞對蛋白酶體抑制劑PS341的敏感性。 第二部分尿多酸肽(CDAⅡ)抗多發(fā)性骨髓瘤作用初步機制研究 目的： 探討CDA—Ⅱ?qū)Χ喟l(fā)性骨髓瘤的作用及機理，為CDA—Ⅱ應(yīng)用于MM治療提供理論依據(jù)。 方法： 采用MTT比色法研究CDA—Ⅱ?qū)PMI8226、U266、M

12、M．1R、MM．1S細胞株以及對MM患者的骨髓單個核細胞的體外生長抑制作用；采用Wright—Giemsa染色、DNA凝膠電泳檢測DNALadder條帶、流式細胞儀AnnexinV/PI雙染色檢測細胞凋亡；JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位的改變；用Western—blot方法檢測CDA—Ⅱ作用后RPMI8226、U266、MM．1R、MM．1S細胞Caspase家族蛋白，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族，凋亡抑制蛋白IAPs家族蛋白的表達，并

13、進一步加用Caspase-3抑制劑Z—DEVD—FMK來觀察實驗結(jié)果；應(yīng)用免疫熒光方法來檢測CDA—Ⅱ?qū)F—κB核轉(zhuǎn)位過程的影響。 結(jié)果： ①CDA—Ⅱ可以明顯抑制RPMI8226、U266、MM．1R、MM．1S細胞株生長，呈時間和劑量依賴性，而且對于患者原代細胞也具有抑制生長的作用，并呈時間和劑量依賴性，但不影響正常人骨髓單個核細胞的生長，對正常骨髓幾乎無抑制作用。②CDA—Ⅱ可以誘導(dǎo)MM細胞株RPMI8226細胞

14、凋亡，可產(chǎn)生典型的DNALadder條帶。③CDA—Ⅱ通過啟動內(nèi)源性細胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細胞凋亡，并伴有明顯的線粒體膜電位下降。④CDA—Ⅱ通過下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1表達，上調(diào)Bax蛋白的表達以及抑制IAPs家族中xIAP和Survivin的表達導(dǎo)致線粒體損傷和Caspase-9，-3激活誘導(dǎo)細胞凋亡。⑤CDA—Ⅱ可以抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位過程，從而使得MM細胞產(chǎn)生凋亡。 小結(jié)：

15、 ①CDA—Ⅱ可以明顯抑制MM細胞株及患者原代細胞生長，呈時間和劑量依賴性。②CDA—Ⅱ可以誘導(dǎo)MM細胞凋亡。③CDA—Ⅱ引起明顯的線粒體膜電位下降，啟動內(nèi)源性細胞凋亡途徑誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細胞凋亡。④CDA—Ⅱ可下調(diào)Bcl-2家族蛋白Bcl-2，Mcl-1表達，上調(diào)Bax蛋白的表達以及抑制IAPs家族中xIAP和Survivin的表達誘導(dǎo)細胞凋亡。⑤CDA—Ⅱ可以抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位而抑制MM細胞生長。 結(jié)論：

16、 TPL能抑制對Dex耐藥及敏感的MM細胞生長，并且該抑制生長的作用不能被IL-6拮抗。其機理主要為抑制PI3K/Akt/NF—κB生存信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡；下調(diào)GR相關(guān)microRNA表達水平，增加GR基因及其p—GR蛋白表達，增加GILZ的表達，從而增加MM．1R、MM．1S細胞對Dex的敏感性。 CDA—Ⅱ可以通過抑制NF—κB的核轉(zhuǎn)位過程，誘導(dǎo)Caspase-3依賴型細胞凋亡，為CDA—Ⅱ用于臨床治療MM提供實驗和