神經(jīng)元型一氧化氮合酶介導(dǎo)氟西汀抗抑郁作用的研究.pdf

1、抑郁癥(depression)是由生物遺傳因素和心理社會(huì)因素引起的情感性精神障礙(affective disorders)，以心境顯著而持久的低落為基本臨床表現(xiàn)并伴有相應(yīng)思維和行為異常的一類精神障礙。抑郁癥發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，雖然建立與發(fā)展了許多學(xué)說，從“傳統(tǒng)單胺假說”、“現(xiàn)代單胺假說”過渡到目前占主導(dǎo)地位的“信號(hào)通路假說”，各種假說對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的解釋錯(cuò)綜復(fù)雜，這些假說均是基于對(duì)抗抑郁藥作用機(jī)制的研究。通過藥物作用機(jī)制研究，認(rèn)識(shí)抑郁癥

2、的發(fā)病機(jī)制，建立各種假說，并有針對(duì)性地發(fā)展新的抗抑郁藥，因此研究抗抑郁藥的作用機(jī)制有著重要意義。 本文關(guān)注的對(duì)象就是神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)在氟西汀抗抑郁作用中的角色。課題應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，旨在闡明兩個(gè)問題：(1)抗抑郁藥是否調(diào)節(jié)nNOs的表達(dá)；(2)nNOS是否介導(dǎo)抗抑郁藥的行為學(xué)作用。最終目的是從整體、細(xì)胞、分子水平，探討nNOS與抗抑郁藥氟西汀的關(guān)系，為臨床抑郁癥的防治和新的抗抑郁藥研發(fā)提供新的思路。

3、 本課題的主要結(jié)果和討論簡(jiǎn)述如下： 1、氟西汀調(diào)控海馬aNOS的表達(dá)未預(yù)知的長(zhǎng)期溫和應(yīng)激(CMS)連續(xù)刺激小鼠21天，成功制備抑郁癥動(dòng)物模型。抑郁狀態(tài)下小鼠海馬nNOs蛋白表達(dá)顯著升高。這暗示nNOS高表達(dá)參與抑郁癥的發(fā)病。 為了說明nNOS可能參與抑郁癥的治療，生理狀態(tài)下予小鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg)連續(xù)11天或21天，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬nNOS的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。 為了進(jìn)一步研究氟西汀對(duì)nNO

4、S表達(dá)調(diào)控的時(shí)效關(guān)系，我們檢測(cè)了氟西汀分別給藥1天、3天、7天的海馬nNOS表達(dá)的改變。結(jié)果顯示氟西汀給藥3天、7天后海馬nNOS表達(dá)顯著下降，急性(1天)給藥后，海馬nNOS表達(dá)與對(duì)照組相比沒有顯著差異。 同樣，我們還檢測(cè)了氟西汀給藥對(duì)NOS活性的影響。結(jié)果表明小鼠腹腔注射氟西汀(10mg/kg)連續(xù)21天后其海馬NOS活性顯著下調(diào)。 這些結(jié)果提示nNOS可能參與5-羥色胺再攝取抑制劑氟西汀的抗抑郁作用機(jī)制。

5、2.三環(huán)類抗抑郁藥對(duì)海馬RNOS表達(dá)的調(diào)控增加突觸間隙去甲腎上腺素濃度的三環(huán)類抗抑郁藥丙咪嗪(20mg/kg，腹腔注射，21天)和去甲丙咪嗪(20mg/kg，腹腔注射，21天)對(duì)小鼠海馬nNOS的表達(dá)沒有影響。而耗竭腦內(nèi)去甲腎上腺素的利血平(0.3mg/kg，腹腔注射，21天)對(duì)小鼠海馬nNOS表達(dá)也沒有影響。這暗示nNOS的表達(dá)可能與突觸間隙去甲腎上腺素遞質(zhì)水平無(wú)關(guān)。 氟西汀顯著下調(diào)nNOS的表達(dá)，這為證明nNOS分子介導(dǎo)抗抑

6、郁藥的作用機(jī)制提供了理論可能性。為了闡明nNos在氟西汀抗抑郁作用中的關(guān)鍵作用，我們使用了兩個(gè)工具：L-精氨酸和nNOS-/-小鼠。L-精氨酸是生理狀態(tài)下唯一由NOS催化的生理性一氧化氮供體。利用L-精氨酸的目的，是升高nNOS來(lái)源的NO，間接阻斷由氟西汀誘導(dǎo)的nNOS-NO下降。 3.L-廣精氨酸削弱氟西汀在強(qiáng)迫游泳、懸尾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕系目挂钟糇饔脼榱岁U明nNOs下調(diào)是否參與氟西汀的抗抑郁作用，我們觀測(cè)了L-精氨酸對(duì)氟西汀抗抑郁作

7、用的影響。強(qiáng)迫游泳(FST)和懸尾實(shí)驗(yàn)(TST)是檢測(cè)抗抑郁作用的最常用急性指標(biāo)。腹腔注射氟西汀(10mg/kg)后30-60分鐘，小鼠在FST和TST實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短，即產(chǎn)生顯著的抗抑郁作用。氟西汀給藥前30分鐘接受L-精氨酸(750mg/kg)預(yù)處理，則小鼠的不動(dòng)時(shí)間較氟西汀所誘導(dǎo)的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，即L-精氨酸有效削弱氟西汀在FST、TST模型上的抗抑郁作用。 為了說明L-精氨酸的作用是通過作為底物促進(jìn)nNOS合成

8、NO而實(shí)現(xiàn)的，我們?cè)O(shè)計(jì)了另一組實(shí)驗(yàn)利用同分異構(gòu)體D-精氨酸來(lái)排除L-精氨酸的作用是通過非NO途徑的其他非特異性作用實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果表明D-精氨酸對(duì)氟西汀所引起的小鼠不動(dòng)時(shí)間縮短沒有影響。這說明L-精氨酸阻斷氟西汀在FsT、TsT模型上的抗抑郁作用可能是通過L-精氨酸-NOS-NO途徑實(shí)現(xiàn)的。 4.L-精氨酸完全阻斷氟西汀在新奇-攝食抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕系目挂钟糇饔眉毙缘目挂钟糇饔貌荒芙忉尶挂钟羲幣R床藥效延遲效應(yīng)，因此我們利用了能解釋臨

9、床藥效延遲效應(yīng)的新奇.攝食抑制實(shí)驗(yàn)(NSF)作為另一檢測(cè)抗抑郁作用的慢性指標(biāo)。腹腔注射氟西汀(10mg/kg)連續(xù)28天后，小鼠在新奇環(huán)境中的攝食潛伏期顯著縮短，即產(chǎn)生顯著的抗抑郁作用。但每日氟西汀給藥前30分鐘接受L-精氨酸(750mg/kg，腹腔注射)預(yù)處理，小鼠的攝食潛伏期則顯著延長(zhǎng)，甚至超過賦形劑對(duì)照組，即L-精氨酸完全阻斷氟西汀在NSF模型上的抗抑郁作用。 同樣我們?cè)O(shè)計(jì)了另一組實(shí)驗(yàn)利用同分異構(gòu)體D-精氨酸來(lái)排除L-精氨

10、酸的作用是通過非NO途徑的其他非特異性作用實(shí)現(xiàn)的。研究結(jié)果表明D-精氨酸對(duì)氟西汀所引起的小鼠攝食時(shí)間縮短沒有影響。這說明L-精氨酸完全阻斷氟西汀在NSF模型上的抗抑郁作用是通過L-精氨酸-NOS-NO途徑實(shí)現(xiàn)的。 我們同時(shí)檢測(cè)了小鼠在熟悉環(huán)境(飼養(yǎng)環(huán)境)中攝食潛伏期和15分鐘內(nèi)的攝食量，排除了氟西汀組小鼠在新奇環(huán)境中的攝食潛伏期的改變是由于食欲亢進(jìn)所致。 5.L-精氨酸削弱氟西汀的促海馬神經(jīng)元增殖作用海馬齒狀回神經(jīng)元再生

11、增加是抗抑郁藥發(fā)揮抗抑郁作用的標(biāo)志之一。既然L-精氨酸可有效阻斷氟西汀在FST、TST、NSF這三種動(dòng)物模型上的作用，那么L-精氨酸能否阻斷氟西汀的促神經(jīng)元增殖作用呢? 氟西汀(10mg/kg，腹腔注射)連續(xù)給藥28d結(jié)束后，予小鼠腹腔注射DNA合成標(biāo)記BrdU(50mg/kg，給藥2次，間隔12小時(shí))，末次給藥后12小時(shí)，4％多聚甲醛灌注固定腦組織，免疫組化鑒定海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明，氟西汀給藥28

12、d可顯著增加海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。氟西汀每日給藥前接受L-精氨酸(750mg/kg，腹腔注射)預(yù)處理，則小鼠海馬BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，接近賦形荊對(duì)照組水平。以上結(jié)果表明L-精氨酸有效削弱氟西汀的促神經(jīng)元增殖作用，提示氟西汀的促神經(jīng)元增殖作用可能是通過L-精氨酸-NOS-NO途徑實(shí)現(xiàn)的。 氟西汀下調(diào)nNOS的表達(dá)，而L-精氨酸有效的削弱了氟西汀的抗抑郁作用，這說明nNOS的下調(diào)介導(dǎo)了氟西汀的抗抑郁作用。為

13、了進(jìn)一步證明這一推論，我們利用了另一個(gè)工具一nNOS基因敲除小鼠。由于nNOS-/-小鼠完全不表達(dá)nNOS，即從另一個(gè)角度阻斷了氟西汀對(duì)nNOS的下調(diào)。 6.nNOS4-/-小鼠特性：對(duì)抑郁抵抗nNOS-/-小鼠海馬NO的含量顯著低于野生型小鼠。 在FST中，在接受同樣的強(qiáng)迫游泳應(yīng)激后，與野生型小鼠相比，nNOS-/-小鼠5分鐘內(nèi)水中不動(dòng)時(shí)間顯著縮短。在NSF中，在新奇環(huán)境中，nNOS-/-小鼠攝食的潛伏期顯著短于野生型

14、小鼠。綜合上述兩個(gè)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們認(rèn)為nNOS-/-小鼠具有對(duì)抑郁抵抗的特性，這充分說明了nNOS蛋白與抑郁癥關(guān)系密切。 7.在強(qiáng)迫游泳模型上，nNOS-/-小鼠對(duì)抗抑郁藥氟西汀沒有反應(yīng)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明選擇性的敲除編碼nNOS蛋白的基因產(chǎn)生抗抑郁行為。為了進(jìn)一步證實(shí)nNOS作為氟西汀的下游在抗抑郁作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們接下來(lái)檢測(cè)野生型小鼠和nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接受氟西汀(10mg/kg)腹腔注射

15、的野生型小鼠在強(qiáng)迫游泳過程中的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短，然而接受氟西汀(10mg/kg)腹腔注射的nNOS-/-小鼠在強(qiáng)迫游泳過程中不動(dòng)時(shí)間沒有改變，即nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀治療沒有反應(yīng)。 8.在新奇-攝食抑制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?，nNOS-/-小鼠對(duì)抗抑郁藥氟西汀沒有反應(yīng). 我們?cè)贜SF模型上再次驗(yàn)證nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀治療的反應(yīng)。氟西汀(10mg/kg，腹腔注射)連續(xù)給藥28天，野生型小鼠在新奇環(huán)境中的攝食潛伏期顯著縮短，然

16、而接受氟西汀治療的nNOS-/-小鼠在新奇環(huán)境中的攝食潛伏期沒有改變，即同樣的抗抑郁藥治療對(duì)nNOS-/-小鼠卻沒有影響。NSF模型上，nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀的反應(yīng)與FST結(jié)果完全一致，再一次證實(shí)nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀的抗抑郁治療極為不敏感。 9.在nNOS-/-小鼠，氟西汀促神經(jīng)元增殖用消失. 氟西汀(10mg/kg，腹腔注射)連續(xù)給藥28天結(jié)束后，予小鼠腹腔注射BrdU(50mg/kg，給藥2次，間隔12小時(shí)

17、)，末次給藥后12小時(shí)，4％多聚甲醛灌注固定腦組織，免疫組化鑒定海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。長(zhǎng)期的氟西汀治療顯著增加了野生型小鼠海馬BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。然而nNOS-/-小鼠雖然接受同樣的長(zhǎng)期氟西汀治療，但其海馬BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)沒有改變。這充分說明了在nNOS-/-小鼠，氟西汀促神經(jīng)元增殖作用消失。 nNOS-/-小鼠對(duì)氟西汀的抗抑郁作用及促神經(jīng)元再生作用沒有反應(yīng)暗示nNOS介導(dǎo)了氟西汀的抗抑郁作用。值得注意的是