一氧化氮合酶與神經(jīng)管畸形關(guān)系的研究.pdf

1、本研究采用乙烯硫脲(Ethylenethiourea．ETU)致畸的大鼠神經(jīng)管畸形動物模型觀察nNOS、iNOS、eNOS在胎鼠大腦皮質(zhì)中表達情況，從血管內(nèi)皮細胞與神經(jīng)細胞相互作用影響神經(jīng)管發(fā)育角度，探討NOS與腦發(fā)育異常的關(guān)系，希望為腦發(fā)育異常機制提供理論根據(jù)。 研究材料和方法： 一、神經(jīng)管畸形大鼠模型制備與動物分組 Wister大鼠80只(中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院實驗動物中心提供)體重250～300克。雌雄(

2、比例3：1)交配后，清晨陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子定為孕0天，在孕10天時，隨機選取50只孕鼠為ETU致畸組，經(jīng)胃管注入1％ETU，劑量為125mg/kg，制作神經(jīng)管畸形大鼠模型。10只為對照組，注入等量生理鹽水。分別在大鼠孕14d、20d時，剖宮取出胎鼠，一部分胎鼠用0.9％的生理鹽水10毫升及4％多聚甲醛20毫升分別進行左心室灌注固定，然后在顯微鏡下取出胎鼠的大腦組織，置于4％多聚甲醛后固定3小時，轉(zhuǎn)入30％蔗糖過夜，將固定好的標本連續(xù)冠狀冰

3、凍切片或石蠟包埋；另一部分胎鼠在顯微鏡下分離新鮮未經(jīng)固定大腦組織，液氮速凍后于-70℃保存。實驗分四組：對照組、給藥無畸形組、脊柱裂組、腦膨出組。 二、神經(jīng)管畸形胎鼠大腦皮質(zhì)的病理改變觀測 1、對E20胎鼠大腦皮質(zhì)進行HE染色，以明確腦膨出胎鼠大腦皮質(zhì)的病理結(jié)構(gòu)變化。 2、應(yīng)用細胞凋亡原位檢測法檢測不同組E20胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡情況，并計算凋亡指數(shù)，進行X<'2>檢驗。 3、應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測bcl

4、-2在E20胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞中的分布和表達，應(yīng)用Western blot法檢測胎鼠大腦皮質(zhì)中caspase-3、bcl-2的蛋白表達半定量分析。 三、神經(jīng)管畸形胎鼠大腦皮質(zhì)中NoS的差異表達檢測 1、應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測nNOS、iNOS、eNOS在E20胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元和腦血管內(nèi)皮細胞中的分布和表達，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測V8腦血管內(nèi)皮細胞中的分布和表達；應(yīng)用Western blot法檢測胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS、

5、iNOS、eNOS的蛋白表達半定量分析。 2、應(yīng)用實時定量：PCR對nNOSmRNA、eNOSmRNA、iNOS mRNA的表達作相對定量分析。 研究結(jié)果 一、神經(jīng)管畸形模型成功制備在大鼠孕10d給予ETU處理后，孕20d剖腹取出胎鼠發(fā)現(xiàn)可出現(xiàn)腦膨出、脊柱裂、無尾、肛門閉鎖等多種畸形。對對照組、給藥無畸形組、脊柱裂組、腦膨出組E20胎鼠大腦皮質(zhì)進行HE染色，發(fā)現(xiàn)給藥無畸形組、脊柱裂組與對照組的胎鼠大腦皮質(zhì)無明顯異

6、常改變，而腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)明顯變薄，細胞數(shù)量減少，部分細胞變性(細胞核淡染，腫脹)。 二、應(yīng)用細胞凋亡原位檢測法檢測不同組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中細胞凋亡情況E20胎鼠大腦皮質(zhì)中Tunel陽性細胞數(shù)目在正常組、給藥無畸形組及脊柱裂組細胞凋亡數(shù)無明顯改變，而在腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)細胞凋亡數(shù)明顯多于對照組，計算凋亡細胞百分率，然后用X<'2>檢驗進行分析，腦膨出組和對照組的細胞凋亡指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 三、

7、免疫熒光技術(shù)檢測E20胎鼠大腦皮質(zhì)中bcl-2的表達差異E20胎鼠大腦皮質(zhì)中bcl-2陽性神經(jīng)元表達量在對照組、給藥無畸形組、脊柱裂組無明顯改變，而腦膨出組bcl-2陽性神經(jīng)元表達量明顯減少。 四、Western-blot檢測E14、E20胎鼠大腦皮質(zhì)中caspase-3、bcl-2蛋白的表達。 1、用Western-blot方法檢測不同組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中easpase-3、bcl-2蛋白表達水平，結(jié)果表明對照組、給

8、藥無畸形組、脊柱裂組胎鼠大腦皮質(zhì)中caspase-3、bcl-2蛋白表達水平無明顯改變，而腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中easpase-3蛋白活化片段表達水平明顯增加，bcl-2蛋白表達水平明顯減少。 2、用Westem-blot方法檢測腦膨出組、對照組E14、E20胎鼠大腦皮質(zhì)中OtiSpase-3蛋白表達水平，結(jié)果表明E14、E20腦膨出組大腦皮質(zhì)中casprise-3活化片段表達明顯高于對照組(P<0.01)。 五、胎鼠大

9、腦皮質(zhì)中nNoS、eNoS和iNoS蛋白的差異表達。 1、利用免疫熒光技術(shù)檢測到給藥無畸形組、脊柱裂組和對照組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量無明顯改變，而腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，計算平均光密度值發(fā)現(xiàn)與其他組相比，腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS表達量明顯減少；給藥無畸形組、脊柱裂組和對照組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中eNOS陽性血管數(shù)量無明顯改變，而腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中eNOS陽性血管數(shù)量增多，

10、計算平均熒光密度值發(fā)現(xiàn)各組胎鼠大腦皮質(zhì)中eNOS的表達無明顯改變，同樣計算V8染色血管數(shù)量及平均熒光密度值亦得到同樣結(jié)果；在各組未檢測到iNOS陽性染色。 2、在Western blot分析中，發(fā)現(xiàn)E20胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS、eNOS蛋白表達在給藥無畸形組、脊柱裂組和對照組間無明顯改變，而腦膨出組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS蛋白表達明顯減少，eNOS蛋白表達增加；在各組未檢測到iNOS蛋白表達。 3、在Westem b

11、lot分析中，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，E14腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS蛋白表達明顯減少，eNOS蛋白表達水平明顯增加，與E20結(jié)果相一致；在E14胎鼠大腦皮質(zhì)中檢測到iNOS蛋白微量表達，但腦膨出組與對照組比較無明顯差異，E20胎鼠大腦皮質(zhì)中未檢測到iNOS表達。 六、不同組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中nNoS mRNA、eNoS mRNA和iNoS mRNA的表達。 1、實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)對照組、給藥無畸形組、脊柱裂組和腦膨

12、出組E20胎鼠大腦皮質(zhì)中nNOS mRNA表達無明顯改變； 2、給藥無畸形組、脊柱裂組和對照組胎鼠大腦皮質(zhì)中eNOSmRNA表達無明顯改變，而腦膨出組胎鼠大腦皮質(zhì)中eNOS mRNA表達明顯增多； 3、在各組未檢測到iNOSmRNA表達。 研究結(jié)論： 1、在用ETU成功制備神經(jīng)管畸形大鼠模型過程中，發(fā)現(xiàn)孕10天是獲得神經(jīng)管畸形大鼠模型的最佳給藥時間。 2、神經(jīng)管畸形中腦膨出胎鼠大腦組織中eNOS表