CoCl-,2-對(duì)神經(jīng)型一氧化氮合酶表達(dá)的作用及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:缺血性腦損傷是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率，致殘率和復(fù)發(fā)率極高。對(duì)其深入研究具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血十分敏感，神經(jīng)系統(tǒng)很多的疾病的發(fā)生，發(fā)展和缺血過(guò)程相關(guān)。在神經(jīng)外科疾病的治療中缺血和低氧也是影響病人預(yù)后的重要因素之一。神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早發(fā)現(xiàn)于大鼠的小腦組織，現(xiàn)已被證明廣泛的存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在維持神經(jīng)元的功能如神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，神經(jīng)

2、元發(fā)育，突觸塑形，調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要的作用，同時(shí)參與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過(guò)程。除了神經(jīng)系統(tǒng)外，還在其他很多組織如骨骼肌，肺，腎臟中發(fā)現(xiàn)了nNOS的表達(dá)。nNOS在體內(nèi)具有多樣而復(fù)雜的功能，它的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)節(jié)也十分復(fù)雜。一氧化氮合酶尤其是神經(jīng)型一氧化氮合酶在神經(jīng)系統(tǒng)缺血過(guò)程中起到重要作用。但是現(xiàn)在對(duì)它在神經(jīng)系統(tǒng)缺血中的作用和調(diào)控的研究存在較大的分歧。我們的研究擬通過(guò)低氧化學(xué)模擬物CoCl2刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH，進(jìn)而

3、探討nNOS在模擬低氧條件下的表達(dá)情況和調(diào)控機(jī)制。預(yù)適應(yīng)是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，在多種動(dòng)物的心臟，肝、腎和腦等多種組織、器官和細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了這種機(jī)制的存在，其中在心臟和腦中這種現(xiàn)象受到特別的關(guān)注。有研究認(rèn)為nNOS在低氧預(yù)適應(yīng)中起到重要作用，我們擬通過(guò)低氧的化學(xué)模擬物CoCl2刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH建立預(yù)適應(yīng)模型，進(jìn)而研究nNOS在低氧預(yù)適應(yīng)中的作用，并對(duì)其預(yù)適應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行初步研究。 材料與方法:1.實(shí)驗(yàn)

4、材料：RNA提取試劑TRIzolReagent購(gòu)自GIBCOBRL，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega，Real-timePCR試劑盒購(gòu)自Takara，一氧化氮熒光染料DAF-Ⅱa購(gòu)自Anxora，Real-timePCR相關(guān)引物和探針購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)有限公司，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，PCR產(chǎn)物純化試劑盒及柱離心膠回收純化試劑盒均購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自MERC

5、K公司產(chǎn)品，瓊脂糖購(gòu)自Promega公司，載體連接系統(tǒng)pMD18-TVector購(gòu)自Takara公司，PGL3-basic報(bào)告基因載體購(gòu)自Promega公司，γ-32pATP購(gòu)自北京福瑞德公司，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自promega公司，抗體購(gòu)自Santacruz公司。 2.實(shí)驗(yàn)方法：以CoCl2為低氧的模擬刺激刺激人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH，提取RNA，進(jìn)行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表

6、達(dá)情況。以熒光染料DAF-ⅡA檢測(cè)在刺激后NO產(chǎn)生情況；Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)探針，以同位素標(biāo)記，以EMSA的方法檢測(cè)nNOSExon1f啟動(dòng)子區(qū)域的低氧反應(yīng)元件(HRE)和C/EBPα反應(yīng)元件的活性，并以ChIP的方法驗(yàn)證。構(gòu)建PGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，在CoCl2的刺激下檢測(cè)其報(bào)告基因的表達(dá)，鑒定反應(yīng)元件的活性。以CoCl2為低氧的模擬刺激對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-

7、N-SH進(jìn)行預(yù)適應(yīng)刺激，以無(wú)血清模擬低氧刺激，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。提取RNA，進(jìn)行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表達(dá)情況。 結(jié)果:1.CoCl2刺激對(duì)SK-N-SH細(xì)胞nNOS基因表達(dá)的影響：Real-timePCR檢測(cè)結(jié)果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS的表達(dá)升高，并且呈時(shí)間和劑量依賴性。DAF-ⅡA熒光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞

8、中NO的含量升高，在應(yīng)用了nNOS特異性拮抗劑7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中NO的含量升高至少有一部分來(lái)源于nNOS.Western-blot結(jié)果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS的蛋白表達(dá)增高，而7-NI可以拮抗這種作用。 2.nNOSExon1f啟動(dòng)子區(qū)域低氧反應(yīng)元件HRE的鑒定：EMSA的結(jié)果顯示nNOSExon1f啟動(dòng)子區(qū)域的HRE可以和轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α結(jié)

9、合。ChIP結(jié)果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和該HRE的結(jié)合增強(qiáng)。pGL3熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果表明在CoCl2的刺激下含HRE的啟動(dòng)子活性增加60％。 3.nNOSExon1f啟動(dòng)子區(qū)域C/EBPα反應(yīng)元件的鑒定：EMSA的結(jié)果顯示nNOSExon1f啟動(dòng)子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)可以和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα結(jié)合。ChIP結(jié)果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和該C/EBPα反應(yīng)元件的結(jié)合增強(qiáng)。pGL3熒光素酶報(bào)告

10、基因的檢測(cè)結(jié)果表明在CoCl2的刺激下含有C/EBP反應(yīng)元件的啟動(dòng)子活性增加30％。 4.CoCl2對(duì)細(xì)胞血清剝奪的保護(hù)作用：CoCl2可以產(chǎn)生保護(hù)作用抵抗無(wú)血清的刺激，nNOS在這個(gè)預(yù)適應(yīng)發(fā)揮重要作用，可以調(diào)節(jié)BCL-2，Apaf-1基因的表達(dá)。 結(jié)論證實(shí)了在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS表達(dá)在mRNA，蛋白和產(chǎn)物水平都升高。表明在神經(jīng)細(xì)胞的低氧反應(yīng)中nNOS起到重要的作用。本研究首次鑒定了nNOSExo