以LRRC4為核心的多相調(diào)控環(huán)路在腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　 LRRC4是與膠質(zhì)瘤密切相關(guān)的腦組織特異性抑瘤基因，在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)或缺失，LRRC4啟動(dòng)子甲基化修飾是其失活的重要分子機(jī)制之一。外源性過表達(dá)LRRC4可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，使膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，LRRC4可通過負(fù)性調(diào)控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信號通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲。miRNA是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，能與靶基因的3'UTR區(qū)堿基不完全或完全配

2、對，并在轉(zhuǎn)錄后水平抑制蛋白的翻譯過程，甚至直接降解mRNA而發(fā)揮負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。
　　 本課題用前期構(gòu)建的外源性LRRC4表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251/LRRC4和對照細(xì)胞系U251/Control，進(jìn)行miRNA芯片分析，篩選受LRRC4調(diào)控的差異miRNA，從miRNA的角度探討LRRC4在膠質(zhì)瘤中的抑瘤作用。
　　 [LRRC4調(diào)控的顯著差異miRNA的GO分析及其在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后分析]
　　

3、 miRNA芯片結(jié)果經(jīng)qRT-PCR證實(shí)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LRRC4后下調(diào)2倍以上的miRNA4個(gè)(miR-182，miR-381，miR-15b，miR-487b)，上調(diào)2倍以上的miRNA3個(gè)(miR-185，miR-155，miR-612)。通過LRRC4所調(diào)控miRNA的預(yù)測靶基因功能顯著性分析，構(gòu)建了以LRRC4為核心的LRRC4-miRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，從該圖可以看出:LRRC4可以調(diào)控多個(gè)miRNA的表達(dá)，一個(gè)miRNA也可

4、以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá);而一個(gè)靶基因的表達(dá)也可以受多個(gè)miRNA的調(diào)控。有趣的是miRNA(miR-182、miR-381、miR-590-3p)和核心靶基因(LRRC4)之間存在著相互調(diào)控的關(guān)系。通過LRRC4調(diào)控的顯著差異的miRNA(miR-182、miR-381和miR-185)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，miR-182和miR-381在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，且miR-182或miR-381表達(dá)越

5、高，患者預(yù)后越差，而miR-185在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中顯著下調(diào)，其表達(dá)越低，患者預(yù)后越差。
　　 [miR-182或miR-381是膠質(zhì)瘤治療的潛在生物靶點(diǎn)，干擾miR-182或miR-381可通過調(diào)控靶基因LRRC4的表達(dá)，抑制BRD7的轉(zhuǎn)錄而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。其中，LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4調(diào)控環(huán)路在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用]
　　 miRNA可以發(fā)揮瘤基因的作用參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增

6、殖和生長。細(xì)胞和裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，miR-182或miR-381可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，因此，miR-182或miR-381是膠質(zhì)瘤治療的潛在生物靶點(diǎn)。干擾miR-182或miR-381通過上調(diào)磷酸化Rb、降低E2F3的表達(dá)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。LRRC4作為膠質(zhì)瘤抑瘤基因是miR-182和miR-381共同調(diào)控的靶基因。我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-182，miR-381和BRD7均與LRRC4在正常腦組織

7、及膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。干擾miR-182或miR-381可通過上調(diào)靶基因LRRC4的表達(dá)，抑制LRRC4介導(dǎo)的ERK/MAPK和PI-3K/AKT信號通路調(diào)控AP-2/SP1/E2F6/C-Myc等轉(zhuǎn)錄因子與BRD7基因的結(jié)合，從而抑制BRD7的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，上調(diào)磷酸化Rb和下調(diào)E2F3的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞向膠質(zhì)樣細(xì)胞分化。
　　 生物信息學(xué)預(yù)測并通過ChIP等實(shí)驗(yàn)證

8、實(shí)轉(zhuǎn)錄因子AP-2正性調(diào)控miR-182的轉(zhuǎn)錄，結(jié)合前面證實(shí)在膠質(zhì)瘤中miR-182抑制靶基因LRRC4的表達(dá)，LRRC4又可通過負(fù)性調(diào)控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信號通路抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-2的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性，因此，在LRRC4，miR-182，AP-2之間形成了LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4調(diào)控環(huán)路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 [miR-185通過抑制靶基因DNMT1調(diào)控全基因組甲基化水平，恢復(fù)LR

9、RC4等高甲基化基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，并通過抑制靶基因CDC42和RhoA的表達(dá)而發(fā)揮抑瘤基因的功能。其中LRRC4-miR-185/SP1-DNMT1-LRRC4調(diào)控環(huán)路在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用]
　　 miRNA也可作為抑瘤基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MTT，細(xì)胞劃痕，Transwell等實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-185可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)和侵襲，而干擾miR-185能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)和侵襲，因而miR

10、-185可能在膠質(zhì)瘤中可能發(fā)揮抑瘤基因的作用。為進(jìn)一步闡明其作為抑瘤基因的功能，我們通過生物信息學(xué)預(yù)測并相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-185可抑制靶基因DNMT1的表達(dá)。DNMT1是維持甲基化必須且最主要的一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，為此我們進(jìn)一步運(yùn)用HPLC-DAD檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-185可抑制靶基因DNMT1下調(diào)全基因組甲基化水平。通過MassArray，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)miR-185下調(diào)LRRC4, GAD1, PCDHA8,

11、PCDHA13, SST, NKDD1A,HISTlH3，PHOX2B，SIX3等9個(gè)高甲基化基因啟動(dòng)子甲基化水平并恢復(fù)這9個(gè)高甲基化基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)。因此，miR-185可通過抑制靶基因DNMT1調(diào)控全基因組甲基化水平，而恢復(fù)LRRC4等高甲基化基因的表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長與侵襲。
　　 根據(jù)GO分析結(jié)果，miR-185主要參與Rho GTP酶活性，而CDC42和RhoA是調(diào)控Rho GTP酶的主要分子。我們的實(shí)

12、驗(yàn)證實(shí)CDC42和RhoA是miR-185的直接調(diào)控靶基因，CDC42或RhoA與miR-185在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。我們的研究表明，miR-185可通過直接抑制靶基因CDC42和RhoA的表達(dá)，間接下調(diào)VEGFA的表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長與侵襲。
　　 在膠質(zhì)瘤中LRRC4的過表達(dá)可顯著上調(diào)miR-185的表達(dá)，而miR-185可通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1調(diào)控全基因組甲基化水平，從而上調(diào)LRR

13、C4等高甲基化基因的表達(dá)。因而在LRRC4，miR-185，DNMT1之間可形成LRRC4-miR-185-DNMT1-LRRC4調(diào)控環(huán)路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。另外我們證實(shí)SP1可正性調(diào)控DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達(dá)，DNMT1可上調(diào)LRRC4的表達(dá)，而LRRC4又可通過負(fù)性調(diào)控ERK/MAPK和PI-3K/AKT信號通路抑制轉(zhuǎn)錄因子SP1的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性。因此，在LRRC4，SP1，DNMT1之間可形成LRRC4-SP1-DNM

14、T1-LRRC4調(diào)控環(huán)路參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　 總之，膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多階段變異累積形成的病理過程?；颉iRNA、轉(zhuǎn)錄因子和DNA甲基化修飾等在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，它們或相互支撐，或相互拮抗，從而構(gòu)成膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)路。綜合我們以上的研究結(jié)果，我們在研究LRRC4通過miRNA發(fā)揮抑瘤功能的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)受LRRC4調(diào)控的miRNA也可以通過其直接調(diào)控的靶基因(如LRRC

15、4)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，或通過直接靶向DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶而調(diào)控全甲基化基因組水平，從而調(diào)控諸如LRRC4等高甲基化基因的甲基化水平和表達(dá)變化，從而在膠質(zhì)瘤中形成了以LRRC4為核心的多相調(diào)控環(huán)路，即LRRC4-AP-2-miR-182-LRRC4、LRRC4-miR-185-DNMT1-LRRC4及LRRC4-SP1-DNMT1-LRRC4。這些調(diào)控環(huán)路在膠質(zhì)瘤中形成了多個(gè)正性反饋的調(diào)節(jié)過程，參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)