β-欖香烯誘導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)其引發(fā)MG-63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文β欖香烯誘導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)其引發(fā)MG63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用研究姓名：梁?jiǎn)紊暾?qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)；外科學(xué)指導(dǎo)教師：楊茂偉201205避光孵育lO分鐘后，上機(jī)檢測(cè)。4、Westernbolt檢測(cè)MG63細(xì)胞cytoC，Bax，AIFcaspase39等凋亡相關(guān)蛋白及HIF1a蛋白和P13l(／AKT／mTor信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。加入蛋白裂解液裂解。收集蛋白樣品后測(cè)定蛋白樣品的濃度，加入適量的上樣緩

2、沖液，煮沸5分鐘后，冷卻到室溫后就可以上樣，將樣品加入到SDSPAGE加樣孔內(nèi)以恒壓80v跑電泳90120分鐘，電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上，采用恒流300mA轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，封閉兩小時(shí)后，用相應(yīng)抗體孵育過夜，第二日清晨加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2小時(shí)，最后采用ECL試劑來檢測(cè)。5、免疫熒光檢測(cè)各組MG63細(xì)胞HIF1a蛋白的表達(dá)情況。加入欖香烯復(fù)合培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，再以4％的多聚甲醛固定l小時(shí)。加入02％的曲拉通做透化處理，在吸盡封

3、閉液后加入(1：100)的HIF—la抗體在4℃條件下孵育過夜。用PBS緩沖液沖洗孑L板，吸取一抗殘液，避光下分別加入TRITC標(biāo)記的二抗，37℃孵育1小時(shí)，后在加入(1：100)的Hest33342染核處理，經(jīng)過PBS沖洗后在熒光顯微鏡下觀察，并拍照。6、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，采用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組別的ROS情況。細(xì)胞內(nèi)的ROS水平采用DCFHDA熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。加入處理藥物作用后加入終濃度30肛M的DCFHDA于37“C孵育lh，

4、每5rain震蕩細(xì)胞一次。用無血清的DMEM培養(yǎng)基沈細(xì)胞3次后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。7、RTPCR檢測(cè)各組MG63細(xì)胞HIF1amRNA的表達(dá)情況。加入欖香烯復(fù)合培養(yǎng)后，收集細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)，PCR擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，并作分析。8、穩(wěn)定表達(dá)HIF1a細(xì)胞株的建立和鑒定。pEGFPC2空質(zhì)粒和pHIF10／EGFPC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，經(jīng)過G418篩選14天后，提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA和總蛋白做鑒定。9、RNA干擾抑制